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放线菌是产生活性天然产物最重要的一类微生物资源,迄今已分离得到12,000多种生物活性物质,约占全部微生物来源活性产物的一半。为开发放线菌资源,寻找新结构的生物活性化合物,本论文以多株不同生境来源的放线菌为实验菌株,开展放线菌次级代谢产物分离、纯化,阐明化合物的结构,并进行生物活性研究。主要内容包括:实验菌株的活性筛选、化学筛选与分子探针筛选;菌株次级代谢产物的分离纯化;单体化合物的结构解析;单体化合物生物活性的初步评价。
以实验室不同来源的30株放线菌为资源菌株,采用小鼠白血病肿瘤细胞P-388为筛选模型,用SRB法对菌株发酵物进行抗肿瘤活性筛选;对无抗肿瘤活性的12株土壤放线菌采用PKSⅠ、NRPS和helogenase分子探针进行基因筛选,并结合菌株发酵物的TLC薄层行为和HPLC图谱特征,确定5株放线菌为本论文的实验菌株,包括2株海洋来源的高活性抗肿瘤菌株,以及3株土壤来源的无抗肿瘤活性、但分子探针筛选呈阳性的菌株。
实验菌株经大量发酵,有机溶剂萃取后,减压浓缩获得发酵粗浸膏,采用薄层色谱,正相、反相硅胶柱色谱,Sephadex LH-20柱色谱,反相高效液相色谱,重结晶等分离纯化手段,从不同生境来源的5株放线菌发酵浸膏中分离获得34个化合物。利用理化性质和波谱学方法(IR,UV,MS,NMR,CD,X-ray)解析了其中31个化合物的化学结构(Fig.1)。其中从高山土壤放线菌Streptomyces sp.IMBJ01的次级代谢产物中分离得到4个化合物(1-4);从南极土壤放线菌Streptomyces sp.GW31-48的次级代谢产物中分离得到9个化合物(5-13);从高山土壤放线菌Streptomyces sp.HZ02的次级代谢产物中分离得到5个化合物(14-18);从海泥放线菌Streptomyces sp.QD08-1的次级代谢产物中分离得到11个化合物(19-29):从海泥放线菌Streptomyces sp.Chq14的次级代谢产物中分离得到5个化合物(30-34)。化合物的结构类型包括大环内酯类化合物(1-3),戊二酰亚胺类化合物(5-12),聚酮类化合物(19-21),异黄酮类化合物(22-25),环二肽类化合物(13,16-17,26-27),生物碱类化合物(30),streptenol类化合物(14-15),甾体化合物(32),苯衍生物(4,18)和其它类化合物(28,31)。其中化合物1-2为结构新颖的含硫大环内酯类化合物griseoviridin B-C,化合物9为新戊二酰亚胺类化合物;化合物5和14为新的天然产物。
以小鼠白血病肿瘤细胞P-388、人白血病肿瘤细胞HL-60,采用SRB法,对化合物(1-3,5-12,19-21)的体外抗肿瘤活性进行了初步评价,并以纸片法测试了以上13个化合物的抑菌活性。结果表明,化合物1-3,5-12对两种肿瘤细胞没有明显的增殖抑制活性;聚酮类化合物19-21对两种肿瘤细胞均有显著的增殖抑制活性,其中化合物19对两株肿瘤细胞的IC50分别为0.12μM和0.09μM。抑菌实验结果表明,化合物19-21则表现了较强的抑菌活性,其中化合物21的抑菌活性最强。其它的生物活性评价仍在进行中。
综上所述,本文从不同生境来源的放线茵中共分离鉴定了34个次级代谢产物。其中从PKSⅠ分子探针筛选呈阳性菌株QD08-1中获得活性聚酮化合物;从PKSⅠ和NRPS分子探针筛选均呈阳性菌株IMBJ01中,分离得到3个罕见的含硫大环内酯类化合物;从。NRPS分子探针筛选呈阳性菌株GW31.48中,分离得到系列的戊二酰亚胺类化合物;从PKSⅠ分子探针筛选呈阳性菌株HZ02中,分离得到2个链状的聚酮化合物strepenol类化合物。这些研究表明,辅助采用PKS/NRPS通用分子探针筛选放线菌资源菌,可扩大实验菌株的选择范围,在一定程度上能克服单纯以生物活性为导向的天然产物分离中高活性旧化合物出现几率高的问题。该筛选技术虽然可以快速鉴别含某种基因的活性菌株,有目的发现某些类型的活性化合物,但如何快速排重、筛选获得能够产生结构新颖的次级代谢产物的活性菌株还需要多学科交叉新技术联合使用。本文的研究结果,为今后深入开展该领域的研究提供了实验基础。