流感病毒通过抗原重配或漂移产生新的病毒，每年在全球引起较高的发病率和死亡率。疫苗是预防流感的主要有效手段。目前上市的流感疫苗主要有灭活苗、减毒活疫苗和重组HA疫苗，基本上都以鸡胚作为生产基质。采用鸡胚生产疫苗的缺点:存在外源因子污染的风险;鸡胚供应周期长，尤其是当大流行流感来袭时有可能因禽流感的流行，会影响鸡胚供应。鉴于此，WHO鼓励开展以哺乳动物细胞代替鸡胚作为流感疫苗生产基质的研究。　　Vero细胞是WHO批准生产人用疫苗的传代细胞系，能够利用生物反应器进行大规模培养，已广泛用于疫苗生产。然而，Vero细胞对流感病毒不敏感，多数流感毒株连续传代效价降为0。流感病毒的高变异性，WHO每年都要根据各监测点提供的信息推测下一年度的流行株。一般地，流行株在鸡胚和Vero细胞产毒量都较低，推选出来的毒株需要与高产母本株遗传重配制备新的疫苗生产用毒株，在流感高发季节来临前必须完成疫苗种子批制备、疫苗生产及其检定，时间紧张。因此，稳定而快速地制备毒种显得尤其重要。本研究以本实验室前期选育出的Vero细胞适应A/kunming/1/2005va作为母本株，比较点突变法和一步克隆技术的效果，并对不同转染方法拯救流感病毒进行研究，建立了以一步克隆法及Effectene Transfection Reagent转染制备Vero细胞流感疫苗候选株的反向遗传学技术。并依此法，以Vero细胞适应株A/kunming/1/2005va的六个核心片段PB2、PB1、PA、NP、NS、M与流行株A/上海嘉定/SWL1970/2015(H1N1)的表面抗原HA和NA组合，拯救出了新的疫苗候选株H1N1嘉定Va，具有在Vero细胞高产的表型。　　鉴于Vero细胞缺乏将流感病毒HA0裂解成HA1的酶，只有在培养液中添加胰酶，病毒才能组装成熟。有血清培养细胞时残留的血清会导致胰酶失活。无血清培养细胞是目前疫苗生产的研究热点，可克服血清成分对病毒培养的干扰，还可消除培养时潜在污染源并利于分离纯化。本研究通过优化生物反应器培养方法和发酵工艺参数，建立了生物反应器，无血清培养流感病毒的生产工艺。并对病毒收获液进行过滤澄清、超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换层析和甲醛灭活等后处理工艺研究。选用不同凝胶及离子介质进行纯化工艺比较研究，最终确定使用Sepharose4Fast Flow和CaptoQ时病毒回收率高，杂蛋白去除率在99％以上，疫苗蛋白含量不高于10μg/剂、DNA残余量≤100pg/剂，以上指标均达到现行中国药典及WHO标准。　　综上所述，本课题建立了反向遗传学快速稳定制备Vero细胞流感疫苗候选株，并以生物反应器微载体无血清培养Vero细胞和流感病毒，首次将Capto Q用于Vero细胞流感病毒纯化，病毒回收率高，制备的流感灭活疫苗安全有效，将促进全球流感疫苗生产技术的升级换代。