研究目的与意义乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位,死亡率占第二位。手术、化疗、放疗、内分泌及分子靶向治疗的综合应用,成为乳腺癌治疗的主要模式。然而,对化疗药物产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)成为导致乳腺癌治疗失败的主要原因。MDR是指肿瘤细胞对一种药物产生耐药的同时,对其他结构不同、作用靶点不同的药物也产生抗药性。MDR1/P-gp由多药耐药相关基因-1(multidrug resistance gene, mdr-1)编码,是腺苷三磷酸结合盒(adenosine triphosphate-binding cassette,ABC)转运蛋白家族成员之一,具有能量依赖性“药泵功能”,可以通过水解ATP产生的能量,将进入细胞内的药物逆浓度泵出细胞外,从而降低药物对细胞的杀伤作用,使细胞产生耐药。研究表明,大约50%乳腺肿瘤多药耐药与P-gp表达有关。葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase, GCS)是鞘脂类物质神经酰胺(ceramide, Cer)代谢途径的关键酶,可以上调mdr-1的表达。GCS可催化UDP-葡萄糖上的糖基以β型糖苷键与神经酰胺相结合,使神经酰胺糖基化成无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide,GlcCer)。研究发现所有MDR细胞鞘糖脂合成增加,其中以GlcCer最明显。在乳腺癌、白血病、肠癌等MDR细胞中均可发现GCS和GlcCer的增加。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NC)是指在恶性肿瘤局部治疗前给予的全身化疗。研究发现,新辅助化疗可以引起多药耐药相关蛋白P-gp、MRP、LRP等表达上调,继而引起MDR。但目前对乳腺浸润性导管癌组织细胞中GCS蛋白表达及局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗后GCS蛋白表达研究较少。本论文第一部分：检测了200例乳腺浸润性导管癌患者中GCS蛋白表达规律；并分析了GCS蛋白表达与患者临床病理参数、分子亚型、预后的关系；以及60例局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗对GCS蛋白表达的影响。除了遗传因素,肿瘤的发生、发展也受到表观遗传修饰的影响。DNA甲基化是人类基因组最为常见的表观遗传学事件之一。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展中起着重要作用。此外,DNA甲基化与MDR的关系也成了当前的研究热点之一。研究表明,mdr-1基因启动子区CpG岛去甲基化,诱导了MDR1/P-gp的表达,与肿瘤化疗耐药有关。GCS基因启动子区亦富含G+C序列,但DNA甲基化是否参与了乳腺癌细胞GCS表达的调控,国内外尚无报道。本论文第二部分：我们从上述200例乳腺浸润性导管癌患者中随机选取了40例GCS(+)和40例GCS(-)的患者,检测了GCS基因的甲基化状态,并分析了其与患者临床病理资料及GCS表达的关系。在细胞实验部分,我们分别检测了乳腺癌细胞株MCF-7(ER阳性)、MDA-MB-231(ER阴性)、T47D(PR阳性)及耐阿霉素细胞株MCF-7/ADM(GCS高表达)的GCS mRNA、蛋白表达及甲基化状态；并观察了去甲基化药物5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxy-cytidine,5-Aza-dc)处理后,乳腺癌细胞株GCS启动子区甲基化状态、GCS mRNA和蛋白表达的改变,探讨了表观遗传学改变对GCS表达调控的影响。GCS基因甲基化,能否为逆转乳腺癌耐药提供新的分子靶点。研究方法与结果第一部分乳腺浸润性导管癌中GCS的表达研究方法：1.从2007年6月到2009年1月搜集济南中心医院和烟台毓璜顶医院病理证实乳腺浸润性导管癌标本200例。所有患者术前均未行放、化疗及其他治疗。采用免疫组织化学SP二步法,检测乳腺浸润性导管癌患者中GCS蛋白的表达情况。2.分析GCS表达与ER、PR、HER-2、Ki67、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移、乳腺癌亚型等临床病理参数之间的关系；对临床资料进行随访,中位随访时间57.9月(38-60月),分析GCS表达与5年无病生存率(five year-disease free survival,5-y-DFS)和5年总生存率(five year-overall survival,5-y-OS)的关系。应用统计学软件SPSS17.0进行数据处理,p<0.05为差异具有统计学意义。3.从2012年1月到2014年1月搜集烟台毓璜顶医院行新辅助化疗的局部晚期乳腺癌患者标本60例,采用免疫组织化学SP二步法,分析化疗前后GCS表达情况。研究结果：1.青年组(<35岁)GCS表达率较中、老年组(≥35岁)明显降低,差异具有统计学意义(p=0.033)。随着肿瘤病理学分级的增高,GCS表达率降低,II-III级浸润性导管癌中GCS表达率显著低于I级(p=0.038)。此外,数据显示,ER阳性组(p=0.030)或HER-2阴性组(p=0.002)乳腺浸润性导管癌患者GCS表达率较相应对照组显著增高。GCS表达率与肿瘤大小、淋巴结转移、Ki67等指标无相关性。2.200例乳腺浸润性导管癌患者,其中导管A型102例,导管B型39例,基底细胞型40例,HER-2阳性19例；导管A型GCS阳性表达率最高；基底细胞型GCS阳性表达率最低；导管A型和基底细胞型相比GCS阳性表达率有统计学意义(p=0.038),与其他亚型相比,差异无统计学意义(p>0.05)。3.GCS表达阳性组5y-DFS(p=0.738)和5y-OS(p=0.714)与GCS表达阴性组相比,无统计学差异。4.60例局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗前GCS表达阳性率是15%(9/60),化疗后GCS表达阳性率是41.7%(25/60),差异有统计学意义(p=0.002)。第二部分乳腺癌中GCS表达的甲基化研究研究方法：1.在200例乳腺浸润性导管癌标本中,随机抽取GCS(+)和GCS(-)标本各40例,甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction, MSP)检测标本中GCS甲基化状况,分析GCS甲基化与临床病理参数及GCS表达之间的关系,实验数据采用SPSS17.0统计学软件进行统计学处理,p<0.05为差异具有统计学意义。2.采用MSP、qRT-PCR和Westernblot检测了MCF-7(ER阳性)、MDA-MB-231(ER阴性)、T47D(PR阳性)及耐药细胞株MCF-7/ADM(GCS高表达)中GCS甲基化状态、GCS mRNA和蛋白表达情况；为了观察DNA甲基化对GCS表达的影响,又进一步检测DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-dc处理后的上述四种乳腺癌细胞株的GCS甲基化状态、GCS mRNA及蛋白表达的变化。研究结果：1.乳腺癌标本中GCS基因异常甲基化检测：乳腺癌标本中GCS(+)组10例发生GCS甲基化,30例未发生甲基化,甲基化率为25.0%；GCS(-)组35例发生GCS甲基化,5例未发生甲基化,甲基化率为87.5%；结果提示：GCS甲基化与GCS表达呈负相关(r=-0.63,p<0.001)。ER(+)组19例发生GCS甲基化,35例未发生甲基化,甲基化率为35.2%；ER(-)组16例发生GCS甲基化,10例未发生甲基化,甲基化率为61.5%；结果提示：GCS甲基化与ER阳性呈负相关(r=-0.249,p=0.026)。HER-2阳性组21例发生GCS甲基化,6例未发生甲基化,甲基化率为77.8%；HER-2阴性组24例发生GCS甲基化,29例未发生甲基化,甲基化率为45.3%；结果提示：GCS甲基化与HER-2阳性呈正相关(r=0.31,p=0.006)。而GCS甲基化与其他病理参数如年龄、病理分级、肿瘤大小、淋巴结转移、Ki67无相关性。2.乳腺癌细胞株中GCS基因异常甲基化检测：MSP结果显示,耐阿霉素细胞株MCF-7/ADM中GCS启动子区非甲基化；ER阴性细胞株MDA-MB-231中GCS启动子区完全甲基化；而MCF-7和T47D细胞株中GCS启动子区部分甲基化。qRT-PCR和Westernblot结果显示,MCF-7/ADM中GCS mRNA和GCS蛋白表达最高,MDA-MB-231中GCS mRNA和GCS蛋白表达最低。而MCF-7和T47D细胞株中GCS mRNA和GCS蛋白表达介于两者之间。3.用甲基化酶抑制剂5-Aza-dc处理后,MDA-MB-231、MCF-7和T47D细胞株中GCS基因甲基化被完全逆转或部分逆转,同时,其GCS mRNA和GCS蛋白表达较未处理组增加；而MCF-7/ADM细胞株中GCS甲基化、GCS mRNA和GCS蛋白表达较未处理组无明显改变。研究结论1.乳腺浸润性导管癌中,GCS蛋白的高表达与ER阳性、HER-2阴性有关；2.GCS在导管A型浸润性乳腺癌中的表达明显高于基底细胞型；3.GCS表达与乳腺浸润性导管癌患者5-y-DFS和5-y-OS无关；4.乳腺癌患者新辅助化疗后GCS表达增加,提示GCS可能参与了乳腺癌患者获得性耐药。5.乳腺癌组织细胞中存在GCS基因启动子区CpG岛甲基化,且GCS基因启动子区甲基化与GCS表达、ER阳性呈负相关,而与HER-2阳性呈正相关；6.乳腺癌细胞株中GCS基因启动子区CpG岛去甲基化,可以上调GCS表达。提示,GCS基因启动子区甲基化参与了乳腺癌细胞GCS表达的调节,可能是乳腺癌化疗耐药的机制之一。