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超低温保存技术不论是在植物种质保存还是脱毒等方面,都具有广阔的应用前景;高效简单的遗传转化体系也一直是植物研究领域的一个重要方向。本研究用微藻、草莓和小麦为材料,在对它们超低温保存条件研究基础上,进行DNA直接转化的尝试。通过分析材料的预处理,高渗溶液组分和脱水保护等环节条件,找到了合适的超低温处理方法,然后对培养条件、DNA包裹、抗生素浓度筛选等一系列转化条件进行了研究,成功的筛选到了抗性材料。得到结果如下:1.本次实验所确定的小球藻的最佳超低温保存体系:藻群体密度OD680在0.800-1.100时,用含有0.5mol/L甘油和0.4mo1/L蔗糖的预处理液在室温处理20min;装载液(30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亚砜+BG-11液体培养基)0℃处理1h;液氮中处理90min,40℃水浴快速解冻,0.4mol/L蔗糖溶液和1.2mol/L的蔗糖溶液各洗涤5min。成活率在55%以上。DNA直接转化微藻合适条件:微藻中加入最终浓度为25mM CaCl2、15%PEG4000、50μl的质粒(30ng/μl)或线性PCR产物、0.198mol/L蔗糖所组成的混合液,在冰上放置30min,转化效率可达到13.63%。2.草莓茎尖超低温保存条件为:传代培养2周后,4℃暗培养16h,25℃光下8h,冷驯化两周;大小约1-2mm草莓茎尖接种到预培养基(MS+2mol/L甘油+0.3mol/L蔗糖+8g/L琼脂),4℃冷适应3d;室温下装载液(MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖)处理20min,冰上在PVS2溶液中处理60min;液氮中过夜;40℃快速解冻;洗涤和恢复培养后,成活率可达到27.36%。转化草莓茎尖条件为:茎尖中加入40μl的100mM CaCl2、60%PEG4000混合,再加入40μl质粒(30ng/μl)存液混合;使溶液浸过茎尖,用枪头拨动,冰中放置30min,摇动两次,室温放置10min。可以在筛选培养基上长出小植株。3.小麦茎尖超低温保存条件为:切取1.5-2.5mm茎尖,加入冷冻保护剂(6%蔗糖+16%DMSO),4℃冰箱存放3h;放入0℃,停留存放30min;-7℃,停留存放1h;-20℃,停留存放1h;-80℃冰箱,停留存放1h,液氮中过夜;从液氮中取出材料,40℃快速解冻。在第15d其成活率可达到62.83%。DNA直接转化小麦茎尖:小麦茎尖中按体积比1:1:1分别加入75μl100mM CaCl2、60%PEG4000、质粒(30ng/μl)为混合液。第15d其转化后小麦茎尖的成活率可达到1.00%,通过定点插入进行转化成活率可达到1.33%。本论文的研究结果对于其它植物的超低温保存和遗传转化具有一定的借鉴意义。不过由于草莓和小麦只是获得了阳性植株而且效率很低,需要以后对影响因素进行更深入研究。