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研究背景:Caveolins(Cavs)是小窝的基本成分,在许多细胞类型中起信号转导调节作用。Caveolin-3(Cav-3)是Cavs家族成员之一,主要表达于心肌细胞的小窝蛋白。越来越多的研究表明,Cav-3在心血管疾病中扮演重要角色,且具有抗心肌细胞凋亡作用。但是,在缺血缺氧损伤心肌细胞中Cav-3的调控机制仍不清楚。大量研究报道,泛素-蛋白酶体系统(UPS)与缺血性心脏病的心功能障碍相关。FAT10(F-Adjacent Transcript-10,FAT10)是最近新发现的一个类泛素蛋白,它包含两个串联的泛素样结构域,参与体内众多蛋白质的翻译后修饰。我们团队首次报道了FAT10具有心肌保护作用。最近,我们团队证实FAT10通过拮抗特异性底物泛素化水平进而稳定底物的表达。然而,在缺血缺氧损伤心肌细胞中FAT10和Cav-3之间的调控关系尚不明确。研究目的:本研究将明确FAT10通过调控Cav-3表达进而抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡,并进一步阐明FAT10调控Cav-3的表达的具体分子机制。这些结果将揭示FAT10通过稳定Cav-3抑制缺血缺氧诱导心肌细胞损伤,并提供实验证据说明FAT10/Cav-3通路可能是缺血性心脏病患者的潜在治疗靶标。研究方法:1.本研究采用CRISPR-Cas9技术构建FAT10敲除(FAT10-KO)大鼠,利用冠状动脉左前降支结扎术(LAD)构建心梗(MI)模型。实验分为四组:野生型大鼠假手术组(WT-Sham)、FAT10-KO大鼠假手术组(FAT10-KO-Sham)、野生型大鼠心梗组(WT-MI)和FAT10-KO大鼠心梗组(FAT10-KO-MI)。2.采用无创血压测定、心电图(ECG)分析心梗术后各组大鼠心功能变化。3.本研究所用细胞包括原代乳鼠心肌细胞(NRCMs)、H9C2细胞以及HEK-293T。构建FAT10基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体(Lv-FAT10和Lv-shFAT10),调节细胞中FAT10的表达。同时,构建Cav-3基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体(Lv-Cav-3和Lv-sh Cav-3),调节细胞中Cav-3的表达。4.FAT10、Cav-3及凋亡相关蛋白Caspase-3表达的检测:采用qRT-PCR法和Western Blot法检测缺血/缺氧损伤后心肌组织或心肌细胞中FAT10、Cav-3及Caspase-3 mRNA和蛋白的表达水平。5.心肌细胞凋亡检测检测:采用流式细胞术及Tunel染色法检测缺血/缺氧损伤后心肌细胞凋亡变化。6.心脏纤维化检测:采用Masson三色染色法检测心肌组织缺血损伤后纤维化形成情况。7.GST(谷胱苷肽巯基转移酶)pulldown实验:检测FAT10与Ub竞争结合Cav-3。8.体外泛素化实验:检测FAT10对心肌细胞中Cav-3泛素化水平的影响。9.统计学分析:所有实验重复至少3次,所有结果均用GraphPad Prism处理,数据以平均值±标准差表示。组间均数比较采用one-way ANOVA和t检验;P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果:1.缺血缺氧损伤心肌细胞中FAT10和Cav-3表达均升高。心梗后,心肌组织中的FAT10和Cav-3蛋白水平显著升高。同时,体外将原代乳鼠心肌细胞进行缺氧处理,发现在与含氧量正常的条件下培养的心肌细胞相比,FAT10和Cav-3的mRNA和蛋白质水平在受到低氧应激的心肌细胞中显著上调。2.FAT10通过调节Cav-3蛋白表达抑制心肌细胞凋亡。为探讨Cav-3对缺氧应激后心肌细胞凋亡的影响,Western Blot和Tunel结果分析显示,与sh-NC组相比,Sh-Cav-3可显著增加缺氧应激反应后心肌细胞凋亡,并且FAT10与Cav-3蛋白表达呈现正相关。为进一步证明上述结果,本研究于沉默心肌细胞中过表达Cav-3,结果显示与阴性对照组相比,Lv-Cav-3组心肌细胞低氧应激后,Caspase3表达显著下降。3.Cav-3是FAT10拮抗心肌细胞凋亡的关键分子。为进一步明确FAT10对缺血心脏中Cav-3表达和心肌细胞凋亡的影响。在NRCMs内转染Lv-FAT10的同时转染Lv-shCav-3,Western Blot结果显示Cleaved-caspase3表达升高,Tunel染色则显示细胞凋亡增加;在转染Lv-shFAT10的同时,转染Lv-Cav-3,Western Blot结果显示Cleaved-caspase3表达降低,Tunel染色则显示细胞凋亡减少。这些证据表明FAT10通过增加Cav-3表达来保护心肌细胞免受缺血性损伤,并提示FAT10参与心梗诱导的心肌细胞凋亡。4.FAT10敲除加重心梗后心脏功能障碍并增加心肌细胞凋亡。研究发现FAT10-KO大鼠心梗术后组织切片Tunel染色发现FAT10-KO-MI组心肌细胞凋亡增加,纤维染色分析同时发现FAT10-KO组心梗术后心肌纤维化更明显(*p<0.05 vs WT-MI)。5.心肌细胞中Cav-3经泛素修饰。为探索FAT10在心肌细胞中对Cav-3表达的调节机制。由于FAT10与Ub结构及功能的相似性,我们需要明确Cav-3是否经泛素化降解。研究发现NRCMs经放线菌酮(CHX)处理后,Western Blot结果显示Cav-3表达下降,而经CHX与蛋白酶体抑制剂(MG132)同时处理后,Western Blot结果显示Cav-3变化不明显,说明Cav-3蛋白表达与UPS相关。6.Cav-3在心肌细胞中经UPS降解。为进一步证实Cav-3经UPS系统降解,我们于H9C2细胞中检测Ub下调后Cav-3泛素化水平变化。Co-IP和体内泛素化检测结果均显示Cav-3在心肌细胞中经UPS降解。7.FAT10通过减少Cav-3泛素化水平进而稳定其表达。上述实验显示Cav-3在心肌细胞中经UPS降解,并且我们先前研究报道FAT10通过拮抗蛋白泛素化来调节底物表达。因此,我们推测FAT10通过影响Cav-3泛素化从而调节其表达。Co-IP结果显示过表达FAT10后,Ub-Cav-3结合物表达减少,而Cav-3表达升高。8.Cav-3蛋白中,FAT10与Ub作用位点相同。我们推测FAT10通过与Ub竞争结合心肌细胞中Cav-3的相同结合位点而影响Cav-3泛素化水平。实验根据Cav-3功能域不同将Cav-3切割为三个片段质粒,Co-IP结果显示FAT10和Ub仅与片段I(D1)存在相互结合,我们将D1中四个赖氨酸位点进行突变,Co-IP结果发现突变后D1与FAT10和Ub结合作用消失。9.FAT10与Ub竞争结合Cav-3并影响其表达。本研究通过使用GST pulldown实验在竞争过程中分析Cav-3与FAT10或Ub的结合情况。研究数据表明FAT10稳定Cav-3是由于FAT10与Ub竞争结合Cav-3并随后减少心肌细胞中Cav-3泛素化降解。结论:1.在缺血心肌组织和缺氧心肌细胞中,FAT10和Cav-3表达均上调。2.过表达FAT10增加Cav-3的表达并抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。3.Cav-3是FAT10缺氧诱导的心肌细胞凋亡中蛋白调节关键效应物。4.FAT10敲除通过减少缺血大鼠心脏中Cav-3表达,加重了心脏损伤并增加心肌细胞凋亡。5.Cav-3在心肌细胞中经泛素—蛋白酶体系统(UPS)降解。6.心肌细胞中,FAT10通过拮抗底物泛素化稳定Cav-3的表达。