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研究目的:铁死亡(Ferroptosis)是一种由铁依赖的脂质过氧化物驱使的非凋亡细胞死亡方式,其典型的生化特征是大量的脂质ROS(LipidROS)异常累积。根据现有的报道,铁死亡的发生机制与细胞的氧化还原平衡失调密切相关:当细胞内负责清除脂质ROS的谷胱甘肽过氧化物酶GPX4活性受到直接或间接的抑制作用时,铁死亡将会启动,最终导致细胞发生死亡。大量的研究表明,铁死亡在肿瘤的发生发展过程中发挥着关键的负性调控作用。因此,激活铁死亡是一种新型的抗肿瘤治疗策略。目前,铁死亡的主要信号通路轴已经建立,但关于铁死亡的调控蛋白或者信号通路的报道仍非常有限,确切的调控网络依旧是未知的。Peroxiredoxin 6(PRDX6)是一种利用GSH作为辅助因子的非硒类过氧化物酶。大量的研究表明,PRDX6具有修复发生过氧化的细胞膜的作用,该过程依赖于其三种酶活:磷脂氢过氧化物酶、钙非依赖的磷脂酶A2和溶血卵磷脂酰基转移酶。因此,在生理还原剂以及底物选择和酶活功能上,PRDX6与GPX4呈现出极大的相似性。本论文文献调研尚未发现有关PRDX6与肿瘤细胞铁死亡的研究报道。因此,本论文将考察PRDX6在肿瘤细胞铁死亡中所扮演的角色,深入探讨PRDX6调控肿瘤细胞铁死亡的分子机制。本研究旨在发现调控肿瘤细胞铁死亡的新蛋白,并阐明其分子机制,进一步丰富和完善铁死亡的调控网络,为基于激活铁死亡的肿瘤治疗提供新思路和新靶点。研究方法:本研究选用非小细胞肺癌细胞株作为主要的研究对象。(1)采用单载体(pLKO-Tet-On)四环素诱导型慢病毒RNA干扰系统结合流式细胞术考察PRDX6蛋白对细胞内LipidROS以及铁死亡过程中的LipidROS的影响;(2)采用shRNA慢病毒干扰瞬时沉默非小细胞肺癌细胞株中的PRDX6蛋白;(3)采用流式细胞术考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中细胞内Lipid ROS的影响;(4)采用SRB法考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中细胞增殖和存活的影响;(5)采用流式细胞术考察过表达PRDX6蛋白对铁死亡过程中细胞内Lipid ROS的影响;(6)采用SRB法考察过表达PRDX6蛋白对铁死亡过程中细胞增殖和存活的影响;(7)采用谷胱甘肽检测试剂盒考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中谷胱甘肽水平的影响;(8)采用Western-blot技术考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中NRF2蛋白表达的影响;(9)采用RT-PCR技术考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中NRF2基因的影响;(10)采用Western-blot技术考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中Keap-1蛋白表达的影响;(11)采用RT-PCR技术考察PRDX6瞬时沉默对铁死亡过程中NRF2蛋白下游基因的影响;(12)采用流式细胞术考察过表达HMOX-1蛋白对铁死亡过程中细胞内Lipid ROS的影响;(13)采用流式细胞术考察PRDX6酶活抑制剂对铁死亡过程中细胞内LipidROS的影响。研究结果:(1)PRDX6蛋白水平下降对肿瘤细胞铁死亡初始化的影响(采用Tet-on-shPRDX6体系,该体系通过多西环素控制细胞内源性PRDX6蛋白的表达):H1299细胞内沉默PRDX6蛋白并不能引起LipidROS水平的上调。该结果表明,沉默PRDX6蛋白并不能导致肿瘤细胞发生铁死亡。(2)PRDX6蛋白水平下降对肿瘤细胞铁死亡的影响(采用Tet-on-shPRDX6体系):①H1299细胞内沉默PRDX6蛋白显著地增加由Erastin诱导的Lipid ROS表达上调,从24.33 ±2.76%上升至49.95 ±2.70%;②沉默PRDX6蛋白进一步增加由不同浓度的RSL-3诱导的Lipid ROS表达上调;③沉默PRDX6蛋白协同Erastin增加的Lipid ROS能够被Ferrostatin-1完全逆转。(3)PRDX6蛋白水平下降对肿瘤细胞铁死亡的影响(采用shRNA慢病毒干扰体系,该体系可瞬时沉默PRDX6蛋白,同时增加了 shPRDX6序列;后续实验均采用该体系,不再赘述):①H1299细胞内沉默PRDX6蛋白显著地增加由不同铁死亡诱导剂诱导的Lipid ROS表达上调:在Erastin组,从19.37 ± 4.55%(shRNA control)分别上升至 85.48 ± 6.06%(shPRDX6#1)和 76.44 ± 7.05%(shPRDX6#2),且能够被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1完全逆转,但程序性坏死抑制剂Necrostain-1和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK对其无明显影响;在RSL-3组,从8.86 ± 1.31%(shRNA control)分别上升至 69.68 ± 1.51%(shPRDX6#1)和 64.34 ± 6.40%(shPRDX6#2);在 Sorafenib 组,从 22.70 ± 2.07%(shRNA control)分别上升至 65.98 ± 2.65%(shPRDX6#1)和 28.06 ± 0.89%(shPRDX6#2);② A549 细胞内沉默 PRDX6蛋白显著地增加由Erastin诱导的Lipid ROS表达上调,从11.74 ±6.67%(shRNA control)分别上升至 35.59 ± 8.01%(shPRDX6#1)和 51.16 ± 5.94%(shPRDX6#2);③H1299细胞和A549细胞内沉默PRDX6蛋白显著地增加由Erastin诱导的细胞增殖抑制,且能能够被Ferrostatin-1完全逆转。以上实验结果表明,PRDX6蛋白是一个调控铁死亡的负性因子。(4)外源性过表达PRDX6蛋白对肿瘤细胞铁死亡的影响:①H1299细胞内过表达PRDX6蛋白显著地减少由不同铁死亡诱导剂诱导的LipidROS上调:在Erastin组,从 46.17 ±1.80%(PCDH vector)下降至 29.65±3.49%(Flag-tag PRDX6);在RSL-3 组,从 61.97 ± 3.93%(PCDH vector)下降至 47.51 ± 2.93%(Flag-tag PRDX6);②H1299细胞内过表达PRDX6蛋白显著地减少由Erastin诱导的细胞增殖抑制,分别从 11.79± 2.30%下降至 5.40± 2.56%(1μM 组),从 17.79± 2.88%下降至 9.00±0.90%(2 μ组),从 23.41 ± 5.53%下降至 13.71 ± 1.59%(4 μM 组)和从 31.19 ±3.78%下降至17.92 ±0.72%(8 μM组)。以上实验结果提示,PRDX6蛋白可能影响着肿瘤细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。(5)PRDX6蛋白对肿瘤细胞铁死亡过程中谷胱甘肽水平的影响:①H1299细胞内沉默PRDX6蛋白不影响GSH表达水平;②H1299细胞内沉默PRDX6蛋白不能够进一步增加由Erastin导致的GSH下调。以上实验结果表明,PRDX6负性调控铁死亡不依赖于GSH的下调。(6)PRDX6蛋白对肿瘤细胞铁死亡过程中转录因子NRF2蛋白以及其下游靶基因的影响:①H1299细胞内沉默PRDX6蛋白进一步增加由Erastin诱导的NRF2蛋白表达上调,在两个shRNA序列中具有一致的结果;②H1299细胞内沉默PRDX6蛋白不影响NRF2基因的转录水平;③H1299细胞内沉默PRDX6蛋白减少Keap-1蛋白的表达水平;④H1299细胞内沉默PRDX6蛋白显著地增加由Erastin诱导的HMOX-1基因表达上调(从7.2倍分别上调至19.5倍(shPRDX6#1)和18.3倍(shPRDX6#2)),但是对 NQO-1、FTH1、FTL、GCLC 和 GCLM 基因没有明显的影响;⑤A549细胞内沉默PRDX6蛋白进一步增加由Erastin诱导的HMOX-1基因表达上调(从8.7倍分别上调至20.2倍(shPRDX6#1)和16.9倍(shPRDX6#2));⑥铁离子整合剂去铁胺Deferoxamine(DFO)能够显著地抑制H1299细胞内沉默PRDX6蛋白协同Erastin增加的Lipid ROS;⑦外源性过表达HMOX-1蛋白显著地增加铁死亡诱导剂诱导的Lipid ROS上调:在Erastin组,从25.63 ± 0.59%(PCDH vector)上升至 41.77 ± 4.74%(Flag tag HMOX-1);在 RSL-3 组,从 25.74 ± 2.27%(PCDH vector)上升至 38.97 ±4.82%(Flag tag HMOX-1)。以上实验结果表明,PRDX6蛋白抑制铁死亡过程中的NRF2-HMOX-1信号通路。(6)PRDX6的磷脂酶A2活性抑制剂MJ33对肿瘤细胞铁死亡的影响:①H1299细胞内小分子抑制剂MJ33不影响LipidROS水平;②H1299细胞中MJ33能够显著地增加由2 μM Erastin诱导的Lipid ROS(从30.76 ± 1.24%上升至45.40 ±6.01%),且能够被 Ferrostatin-1 完全抑制(从 45.40±6.01%下降至 0.92±0.55%);③在PRDX6蛋白表达水平下降的H1299细胞内,MJ33不能够进一步增加Erastin诱导的LipidROS上调;④A549细胞内不同浓度的MJ33(5、10、15、20、25μM)均能够增加由Erastin(10 μM)诱导的Lipid ROS(从17.23%分别上升至21.54%、29.29%、33.14%、38.21%和47.81%)。以上实验结果表明,PRDX6蛋白能够利用自身的磷脂酶A2酶活清除铁死亡过程中的Lipid ROS。研究结论:本研究发现PRDX6蛋白是一个新的肿瘤细胞铁死亡的负性调控因子。它的蛋白表达水平影响着肿瘤细胞(特别是非小细胞肺癌细胞株)对铁死亡诱导剂的敏感性。肿瘤细胞内沉默PRDX6蛋白能够显著地增加铁死亡诱导剂(Erastin、RSL-3和Sorafenib)诱导的LipidROS产生和细胞增殖抑制。在分子机制层面:一方面,PRDX6蛋白抑制肿瘤细胞中NRF2-HMOX1信号轴,减少HMOX-1基因的表达;另一方面,PRDX6蛋白利用其自身的钙非依赖的磷脂酶A2酶活,清除肿瘤细胞铁死亡过程中的一部分LipidROS,减少其累积。本研究不仅仅发现了 PRDX6蛋白在肿瘤细胞铁死亡中新的生物学功能,而且丰富和完善了铁死亡的调控网络,为基于激活铁死亡的抗肿瘤治疗策略提供了潜在靶点。