海鞘(Ascidian)是尾索动物亚门(Uro-chordata)海鞘纲(Ascidiacea)的尾索动物,主要分布在热带及亚热带海域,海鞘中含有许多有生理活性的化合物,这些活性化合物有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等作用。皱瘤海鞘Styela plicata在我国南海有大量分布,研究皱瘤海鞘的药用价值,对开发利用我国的这一丰富资源具有一定的现实意义。研究目的课题组前期研究发现皱瘤海鞘在体内外对乙型肝炎病毒(HBV)都有一定的抑制作用,显示出良好的研究和开发前景。因此,本课题拟对皱瘤海鞘对同是具有包膜的DNA病毒单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)药效活性和作用机制进行研究。为进一步了解皱瘤海鞘的抗病毒谱,为新型抗病毒药物的研究和开发提供理论依据,为皱瘤海鞘的进一步深入研究和开发利用提供科学的理论基础。研究方法1.皱瘤海鞘体外抗HSV-2药效学研究运用HSV-2在非州绿猴肾细胞(Vero细胞)上的增殖模型,通过观察细胞病变(CPE法)和四甲基偶氮唑盐比色法(MTT比色法)检测细胞活性,以病毒抑制率和治疗指数(TI)为指标对皱瘤海鞘体外抗HSV-2的药效活性作用进行评价。2.皱瘤海鞘体外抗HSV-2病毒作用机制研究运用HSV-2在Vero细胞上的增殖模型,在HSV-2复制的不同阶段用药物进行干预,运用CPE法结合MTT比色法检测细胞存活率,以病毒抑制率和TI为指标考察了药物在体外对HSV-2病毒直接杀伤作用、对HSV-2吸附的阻断作用、对HSV-2病毒生物合成的抑制作用和在不同时间点加入药物对HSV-2复制的抑制作用；运用荧光定量PCR方法,从分子水平上探讨了皱瘤海鞘对HSV-2DNA双链复制的影响；运用RT-PCR方法进一步研究皱瘤海鞘对HSV-2DNA聚合酶基因表达的影响。3.皱瘤海鞘对阴道感染HSV-2小鼠的保护作用运用小鼠阴道感染HSV-2的致病模型,研究了皱瘤海鞘对小鼠生殖器疱疹的治疗作用。以小鼠外阴病变程度评分和小鼠阴道粘膜组织病理学检查为指标评价皱瘤海鞘对生殖器疱疹的治疗作用。4.皱瘤海鞘体内抗HSV-2作用机制研究运用小鼠阴道感染HSV-2的致病模型,研究了皱瘤海鞘对小鼠免疫细胞的的调节作用。在治疗周期结束后,小鼠处死,取小鼠外周血抗凝,流式细胞术测定CD4, CD8阳性T细胞百分比,比较用药后各组小鼠外周血T细胞亚群的差异,评价皱瘤海鞘对小鼠的免疫功能的调节作用。运用小鼠阴道感染HSV-2的致病模型,研究了皱瘤海鞘对小鼠Th细胞因子的调节作用。在治疗周期结束后,小鼠处死,取小鼠外周血,收集血清,用酶联免疫吸附分析法测定血清中IL-2, IFN-y, IL-4, IL-10水平。比较用药后各组小鼠外周血IL-2, IFN-y, IL-4和IL-10的差异,评价皱瘤海鞘对小鼠的免疫功能的调节作用。5.皱瘤海鞘抗HSV-2活性有药效部位的筛选运用HSV-2在Vero细胞上的增殖模型,以CPE法和MTT比色法检测细胞活性。以细胞存活率和半数细胞毒性浓度(CC50)为指标考察药物的细胞毒性；以病毒抑制率为指标,对皱瘤海鞘氯仿部位、正丁醇部位,水部位体外抗HSV-2的药效活性作用进行评价；以病毒抑制率为指标考察了皱瘤海鞘水部位在体外对HSV-2病毒直接杀伤作用、对HSV-2吸附的阻断作用以及对HSV-2病毒生物合成的抑制作用。6.统计学处理本文所有计量资料数据均采用单因素方差分析方法进行,先进行方差齐性检验,若方差齐,则应用One-way ANOVA方法进行整体检验,用LSD方法进行组间多重比较,若方差不齐,则应用Welch方法进行整体检验,用DunnettT3方法进行组间多重比较。等级资料数据应用多个独立样本非参数检验进行分析。P<0.05,可认为组间比较具有统计学意义,数据用SPSS13.0软件处理。研究结果1.药物对Vero细胞毒性实验结果显示,与细胞对照组比较,皱瘤海鞘各组吸光度值均无统计学意义(P>0.05), ACV组在1 mg/ml浓度以下各组均无统计学意义(P>0.05)。皱瘤海鞘对Vero细胞的毒性作用小,在10mg/ml浓度下细胞存活率仍有74.88%,其对Vero细胞的CC50值大于10mg/ml,阳性对照药ACV的CC50为1.57mg/ml。2.药物对HSV-2致细胞病变的抑制作用实验结果显示,皱瘤海鞘各组吸光度值与病毒对照组比较均具有统计学意义(P<0.01),阳性对照药阿昔洛韦(acylovir, ACV) 0.01～0.04 mg/ml组吸光度与病毒对照组比较均具有统计学意义(P<0.01)。皱瘤海鞘对HSV-2的半数有效浓度(EC50)为0.40 mg/ml, TI>25,对HSV-2感染Vero细胞显示出较强的保护作用；ACV50%病毒抑制率药物浓度EC50=0.0067mg/ml,治疗指数TI=224,对HSV-2显示出较强的抑制作用。3.皱瘤海鞘对HSV-2直接杀伤活性应用MTT法测定细胞活性,计算皱瘤海鞘对HSV-2病毒的抑制率。结果显示,皱瘤海鞘在1 mg/ml时吸光度与病毒对照组比较具有统计学意义(P<0.01),在2和1 mg/ml时,其对病毒抑制率分别达74.19,64.52%,EC50为0.63mg/ml, TI值大于15.87。结果表明,皱瘤海鞘对病毒具有一定的直接杀伤活性。4.皱瘤海鞘对HSV-2增殖的影响运用MTT法测定细胞活性,计算皱瘤海鞘对HSV-2病毒的抑制率。实验结果显示,皱瘤海鞘2和1mg/ml组吸光度与病毒对照组比较均具有统计学意义(P<0.05),在2和1mg/ml时,其对病毒的抑制率分别达82.98%和65.96%,在0.25mg/ml时,其对病毒抑制率也达29.79%。其ECso值为0.66mg/ml, TI值大于15.15,实验结果提示,皱瘤海鞘对病毒复制具有一定的抑制作用。5.皱瘤海鞘对HSV-2吸附的阻断作用运用MTT法测定细胞活性,计算皱瘤海鞘对HSV-2病毒的抑制率。实验测得皱瘤海鞘各组吸光度值与病毒对照比较均无统计学意义(P>0.05),经计算求得,其在2mg/ml时,其对病毒抑制率达只有23.08%,没有超过50%。实验结果提示皱瘤海鞘对病毒的吸附没有阻断作用。6.在病毒感染前后不同时间点加入皱瘤海鞘对HSV-2病毒的影响运用MTT法测定在不同时间点加入皱瘤海鞘对病毒复制的抑制作用,计算皱瘤海鞘对HSV-2病毒的抑制率。结果显示,在病毒感染前2小时和感染后0,2,4,6小时加入药物,最后测得的吸光度值与病毒对照比较均具有统计学意义(P<0.01)；病毒在感染后0,2小时加入药物对病毒抑制率达65%以上,对病毒显示出明显的抑制作用。在感染后4,6小时加入药物,对病毒抑制率分别是41.27%,34.92%,在感染后10小时加入药物,对病毒复制没有抑制作用。7.荧光定量PCR方法测定皱瘤海鞘对HSV-2病毒DNA复制的影响实验结果显示,与病毒对照组比较,皱瘤海鞘2,1,0.5 mg/ml组能使HSV-2DNA拷贝数下降2-3个数量级,差异具有统计学意义(P<0.01)。实验结果提示,皱瘤海鞘对HSV-2 DNA链复制有一定抑制作用。8. RT-PCR法检测皱瘤海鞘对HSV-2 DNA聚合酶UL30基因表达的影响RT-PCR扩增40个循环后,所有样品均能扩增出特异性的β-actin片段,在皱瘤海鞘(2mg/ml)组和ACV组的均能检测到DNA聚合酶UL30 mRNA的表达,但是与病毒对照组相比,表达量显著降低,提示皱瘤海鞘对HSV-2DNA聚合酶的基因表达具有一定的干扰作用。9.皱瘤海鞘对小鼠生殖器疱疹的治疗作用病毒攻击后,经过连续7天治疗。实验结果显示,海鞘可明显减轻阴道感染HSV-2小鼠外阴肿胀,缩短病程。与模型组比较,阳性药ACV组,海鞘高、低剂量组小鼠外阴病变评分都较小,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠阴道组织病理学检查,光镜下,正常组的阴道粘膜完整,没有炎细胞浸润,没有损伤表现。模型组小鼠阴道粘膜损伤严重,有大量的出血点,有大量炎细胞浸润；ACV组,皱瘤海鞘高、低剂组阴道粘膜损伤较轻,只有少量炎细胞浸润,没有出血点。结果表明,皱瘤海鞘对小鼠生殖器疱疹具有一定治疗作用。10.皱瘤海鞘对感染HSV-2小鼠外周血T细胞亚群的影响病毒攻击后,连续给药治疗7天。实验结果显示,与空白对照组相比较,模型对照组外周血中CD4+T细胞,CD8+T细胞百分比均具有显著差异(P<0.01),可认为造模后两者均显著减少,免疫功能受到一定抑制。ACV治疗组、海鞘治疗组和模型对照组相比,小鼠外周血中CD4+T细胞,CD8+T细胞百分比均有显著差异(P<0.01),可认为经治疗后,CD4+T细胞和CD8+T细胞数量有了显著提高。与空白对照组相比较,模型组外周血CD4+T细胞/CD8+细胞比值有显著差异(P<0.01),可认为模型组CD4+T细胞和CD8+细胞平衡失调。ACV治疗组、皱瘤海鞘治疗组和模型对照组相比,外周血CD4+T细胞/CD8+细胞比值均具有显著性差异(P<0.01,P<0.05),可认为经治疗后,小鼠T细胞平衡失调得到明显改善；与正常组比较,皱瘤海鞘治疗组CD4+T细胞/CD8+细胞比值无显著差异(P>0.05),ACV治疗组CD4+T细胞/CD8+细胞比值有显著差异(P<0.01)。11.皱瘤海鞘对小鼠IL-2, IFN-γ细胞因子水平的影响病毒攻击后,连续给药治疗7天。实验结果显示,与空白对照组相比较,模型对照组小鼠血清IL-2水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较,皱瘤海鞘高、低剂量组小鼠血清IL-2水平均有显著增加(P<0.01),可认为皱瘤海鞘能提高小鼠IL-2的表达水平；与模型组比较,阳性药(ACV)组小鼠血清IL-2水平有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较,各组小鼠血清IFN-y水平均无显著性差异(P>0.05)。12.皱瘤海鞘对小鼠IL-4,IL-10细胞因子水平的影响病毒攻击后,连续给药治疗7天。实验结果显示,与空白对照组相比较,模型对照组小鼠血清IL-4, IL-10水平无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较,阳性药(ACV)组小鼠血清IL-4,IL-10水平均无显著性差异(P>0.05)；皱瘤海鞘高、低剂量组与模型组比较,小鼠血清IL-4, IL-10水平均具有显著性差异(P<0.01,P<0.05),可认为皱瘤海鞘能够提高致病小鼠IL-4,IL-10水平。13.皱瘤海鞘不同部位对Vero细胞毒性MTT法测定皱瘤海鞘不同部位对Vero细胞毒性。实验测得皱瘤海鞘氯仿部位、正丁醇部位和水部位0.08～10 mg/ml组吸光度值与细胞对照组比较均具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)；皱瘤海鞘氯仿部位对Vero细胞的CC50为4.62mg/ml,皱瘤海鞘正丁醇部位对Vero细胞的CCso大于10mg/ml,皱瘤海鞘水部位对Vero细胞的CC50大于10mg/ml。14.皱瘤海鞘氯仿部位对HSV-2致细胞病变抑制效应MTT法测定皱瘤海鞘氯仿对HSV-2致细胞病变抑制效果,结果显示,各浓度组吸光度值与病毒对照组比较均无统计学意义(P>0.05),2mg/ml皱瘤海鞘氯仿部位对HSV-2抑制率为19.23%,没有达到50%。实验结果表明,皱瘤海鞘氯仿部位对HSV-2无抑制作用。15.皱瘤海鞘正丁醇部位对HSV-2致细胞病变抑制效应MTT法测定皱瘤海鞘正丁醇部位对HSV-2致细胞病变抑制效果,结果显示,各浓度组吸光度值与病毒对照组比较均无统计学意义(P>0.05),2mg/ml皱瘤海鞘正丁醇部位HSV-2抑制率为11.54%。实验结果表明,皱瘤海鞘正丁醇部位对HSV-2无抑制作用。16.皱瘤海鞘水部位对HSV-2致细胞病变抑制效应MTT法测定皱瘤海鞘水部位对HSV-2致细胞病变抑制效果。结果显示,2、1及0.5 mg/ml浓度组吸光度值与病毒对照组比较均具有统计学意义(P<0.01,<0.05),2,1 mg/ml瘤海鞘水部位对HSV-2病毒抑制率分别达到91.43%,77.14%,其EC50为0.67mg/ml, TI值大于14.93,结果表明,皱瘤海鞘水部位对HSV-2具有一定抑制作用。17.皱瘤海鞘水部位对HSV-2增殖的影响MTT法测定皱瘤海鞘水部位对HSV-2增殖的影响。实验结果显示,皱瘤海鞘水部分各浓组吸光度值与病毒对照组比较均无统计学意义(P>0.05),皱瘤海鞘水部位2、1和0.5mg/ml时,其病毒抑制率分别达82.98,65.96和63.93%,EC50=0.49mg/ml, T>20.41。结果表明,皱瘤海鞘水部位对HSV-2增殖具有一定抑制作用。18.皱瘤海鞘水部位对HSV-2直接杀伤作用MTT法测定皱瘤海鞘水部位对HSV-2直接杀伤作用,结果显示,皱瘤海鞘水部位各浓度组吸光度值与病毒对照组比较均无计学意义(P>0.05),皱瘤海鞘水部位在2和1mg/ml时,其病毒抑制率分别达74.29%,60.00%, EC50=0.80mg/ml,T>12.50。结果表明,皱瘤海鞘水部位对病毒具有一定的杀伤活性。19.皱瘤海鞘水部位对HSV-2吸附的阻断作用MTT法测定皱瘤海鞘水部位对HSV-2吸附的阻断作用。实验结果显示,皱瘤海鞘水部位各组吸光度值与病毒对照组比较均无统计学意义(P>0.05),在2mg/ml时,其病毒抑制率只有19.23%,没有达到50%。实验结果表明皱瘤海鞘水部位对HSV-2病毒吸附没有阻断作用,研究结论1.运用细胞模型证实皱瘤海鞘对HSV-2复制具有抑制作用。2.运用细胞模型证实皱瘤海鞘对HSV-2具直接杀伤作用,对HSV-2生物合成具有抑制作用,而对HSV-2吸附侵入细胞没有阻断作用。3.运用细胞模型证实皱瘤海鞘对HSV-2 DNA链复制延长具有抑制作用,其作用靶点之一是抑制HSV-2 DNA聚合酶基因表达。4.皱瘤海鞘能够对阴道感染HSV-2小鼠生殖器疱疹具有治疗作用。5.皱瘤海鞘能够提高阴道感染HSV-2小鼠外周血液CD4+和CD8+T细胞亚群百分比,调节小鼠T细胞亚群的平衡；能提高阴道感染HSV-2小鼠血液Th细胞因子水平,从而调节和改善小鼠的免疫功能。这些可能是其对生殖器疱疹具有治疗作用一个有效机制。6.皱瘤海鞘提取物抗HSV-2的有效活性部位是水溶性成分,而不是正丁醇和三氯甲烷等有机溶剂部位,其最可能的成分是小分子多肽等物质。