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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的接触性传染病。该病主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。该病于1987年首先发现于美国,随后波及多个国家和地区。我国1991年在台湾发现该病,郭宝清在1996年首次从流产胎儿中分离到PRRSV,证实了PRRSV在我国的存在(郭宝清,1996)。2006年下半年的“无名高热”疫情在我国南方大面积暴发,最后确诊为高致病性PRRS。该病造成较高的发病率和死亡率,而且临床症状逐渐复杂,流行范围逐渐扩大。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。本课题共分为三部分:1 PRRSV变异毒株SD-TA株的分离鉴定及序列分析2008年从猪“高热病”病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(SD-TA株),该病毒能够被抗PRRSV阳性猪血清所识别。根据GenBank PRRSV经典株(VR-2332)和变异株(JXA1)基因序列分别设计合成了10对引物,利用RT-PCR扩增其基因序列,分别得到了预期的基因片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNASTAR软件分析,与国内外已发表毒株的序列进行比较。结果显示,与美洲型相比,PRRSV SD-TA株相应基因核苷酸同源性为89.3%～99.1%,并且在Nsp2上缺失了30个氨基酸;与欧洲型代表毒株LV株相比同源性为59.9%。遗传关系表明:SD-TA株属于高致病性变异株。2猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达、纯化与单克隆抗体的制备将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株的N蛋白基因的重组质粒pET-30 a(+)-ORF7经鉴定后转化入Rosetta感受态细胞并进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白大小约为21KD。将纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,以表达的融合蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞上清进行抗体检测,并通过有限稀释法,获得了1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为6D10。经Western-blot检测,所获得的单克隆抗体6D10能与N蛋白发生特异性反应,并经间接免疫荧光检测结果表明,所获得的单克隆抗体6D10能与PRRSV经典株(VR、BJ和疫苗株MLV)和高致病性变异株(SD-TA、2#和4#株)产生特异性反应。3唾液酸粘附素的克隆测序、表达以及蛋白纯化根据GenBank NM-214346基因序列分别设计了5对引物,从PAM细胞中利用RT-PCR扩增唾液酸粘附素基因序列,结果分别得到了预期的基因片段,其大小分别为:1125bp、1062bp、1101bp、1182bp和1200bp。将扩增的cDNA片段克隆pMD18-T载体并测序。将构建的重组质粒pET-28a-Sn-1~5经限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后转化入Rosetta感受态细胞并进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白大小分别约为41.4KD、36.7KD、38.5KD、42.3KD和42.9KD,与预期结果相吻合。经Western-blot检测,所获得的各段重组蛋白均能与抗His-单克隆抗体发生特异性反应。