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目的:金银花是常用大宗药材之一,具有多种药理活性,在临床用药及药品、食品开发领域应用广泛。由于金银花市场供需关系紧张,导致金银花质量参差不齐。中药材现场快速检测技术是中药市场对中药鉴定工作的迫切需求。免疫检测技术具有操作简单、灵敏度高、检测快速、通量高等优点,适用于中药质量控制研究。基于药典中规定的金银花质量控制指标性成分,通过单克隆抗体制备技术和胶体金标记抗体技术,建立金银花绿原酸和木犀草苷的免疫检测方法,实现金银花质量的现场快速检测,作为药典方法的补充。方法:分别以绿原酸和木犀草素-7-O-葡萄糖酸苷为半抗原,采用活泼酯法合成绿原酸和木犀草苷完全抗原。通过紫外扫描法鉴定抗原合成结果。免疫抗原多次免疫小鼠后,利用单克隆抗体制备技术分别筛选针对绿原酸和木犀草苷结构的特异性单克隆细胞株,制备单克隆抗体。以所制备的完全抗原和单克隆抗体为基础,建立绿原酸和木犀草苷的间接酶联免疫检测方法(icELISA),实现绿原酸和木犀草苷含量的快速、高通量检测。另外,利用胶体金标记单克隆抗体,制备胶体金免疫检测试纸条。金银花、山银花样品和部分中成药样品经提取稀释后,在5-10 min内即可对金银花中的绿原酸和木犀草苷的含量进行快速检测,实现金银花药材及中成药质量的快速现场鉴定。结果:分别制备了绿原酸和木犀草苷单克隆抗体,其中绿原酸单克隆抗体CGA2E2,效价约为8 000,亲和常数为1.8×10-12 M,抗体类型为IgG1类,轻链为κ型;CGA2E2对异绿原酸A交叉反应率为17.53%,对异绿原酸B、异绿原酸C、新绿原酸和隐绿原酸交叉反应率均小于5.0%,对咖啡酸、奎宁酸、阿魏酸、肉桂酸、1,3-二咖啡奎宁酸等无交叉反应。木犀草苷单抗LG3A4效价约为4000,亲和常数为2.8×10-10 M,抗体类型为IgG1类,轻链为κ型;单抗LG3A4对木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷交叉反应率为2414%;对黄芩苷和野黄芩苷交叉反应率分别为402%和230%;对其他结构类似物交叉反应率均小于1.0%。利用所获得的特异性单克隆抗体,分别建立了绿原酸和木犀草苷的间接竞争ELISA检测方法(icELISA),其中绿原酸icELISA的IC50值为0.4 ng/mL,最低检测极限为0.04 ng/mL,检测范围为0.1-1.5 ng/mL。添加回收率为88.4%~104.8%。木犀草苷icELISA的IC50值为42.3 ng/mL,最低检测极限为3.9 ng/mL,检测范围为9.1-258.1 ng/mL。添加回收率在82.9%~112.5%之间。利用所建立的icELISA检测方法对不同产地的金银花样品进行检测,检测结果经HPLC验证,二者的相关性均在0.96以上,表明,所建立的icELISA可以用于金银花中绿原酸和木犀草苷的含量检测。利用胶体金标记抗体技术,分别制备了绿原酸和木犀草苷胶体金免疫检测试纸条,其中绿原酸试纸条的检测范围为50~100 ng/mL,试纸条对异绿原酸A、隐绿原酸、新绿原酸的交叉反应率分别为:12.5%、5%、5%,对其他有机酸类成分无交叉。木犀草苷试纸条的检测范围为200~400 ng/mL,该试纸条对木犀草素-7-O-葡萄糖酸苷(8 000%)、黄芩苷(1 000%)和野黄芩苷(666%)有较高交叉反应,对其他黄酮类成分无交叉。按照药典的样品提取方法和限量规定,利用试纸条检测金银花样品,可在5-10 min内对金银花的质量(合格性)进行快速评价。此外,绿原酸检测试纸条还可用于中成药中绿原酸含量的合格性检测,木犀草苷检测试纸条可用于部分成方制药中金银花原料的定性检测。结论:ELISA检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测快速、高通量等优点,适合中药材质量的高通量快速检测。胶体金免疫检测试纸条,具有灵敏度高、检测快速、结果可视化、便于携带、无仪器依赖等优点,在中药材现场快速检测方面应用前景广阔。