2009年以来,舒伯特气单胞菌为病原的类结节病在鳢科鱼类中暴发,给鳢养殖业造成了严重的经济损失。该病典型症状为肾、肝、脾点状白色类结节结构,此症状在气单胞菌病中非常少见。目前,国内外舒伯特气单胞菌致病机理的研究较少,其生物学特性和致病机理的研究,对该病的诊断和防治具有重要意义。本项目利用全基因组测序、组织病理分析、激光共聚焦活体成像观察、转录组测序、荧光定量PCR检测等技术对类结节病的病原特性、病理特征和致病机制等进行了研究,主要结果如下:1.鱼源舒伯特气单胞菌的菌株生物学特征。利用多位点序列分型(MLST)发现近两年流行的43株舒伯特气单胞菌分为同一个ST331型;基因组重测序分析发现近10年来的10株菌株基因组差异较小,亲缘关系较近;药敏分析研究发现,近年来菌株耐药性有增加的趋势,耐药性的增加与其基因携带的耐药基因有关;罗非鱼源菌株与鳢源菌株基因组差异较小,形态特征、生长特性、生理生化特性等主要生物学特征基本相似。2.舒伯特气单胞菌的致病性特征。鳢源菌株WL-2具有淀粉酶活性,不具有蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性,具有一定的抗血清能力;人工感染实验发现舒伯特气单胞菌对杂交鳢毒力较强,高温可以极大增强鳢源菌株WL-2的毒力;定量检测和活体成像观察发现鳃和肠是舒伯特气单胞菌重要的入侵部位,脾和肾是主要的增殖场所。3.舒伯特气单胞菌感染的病理形态学特征。感染后组织病理分析显示:脾、肾和肝中可观察到大量肉芽肿结节,大量巨噬细胞聚集吞噬病原菌,推测脾、肾和肝是感染靶器官,肉芽肿是感染的主要症状,巨噬细胞是吞噬细菌的主要细胞;肉芽肿是渐进性形成的,其典型结构可分为三层:中心为病原菌细菌和坏死细胞,外面包裹上皮样细胞,最外围为多层纤维细胞包绕。4.舒伯特气单胞菌与吞噬细胞的相互作用关系研究。印片观察确认病原菌可能在吞噬细胞中存活,引起细胞死亡并释放。对病原菌在鱼体内示踪观察,发现中性粒细胞和巨噬细胞能在宿主体内聚集并吞噬病原菌,巨噬细胞可能促进了病原菌的扩散;对病原菌感染小鼠巨噬细胞后的活体计数和示踪研究,确认病原菌可在小鼠巨噬细胞中存活、增殖。5.杂交鳢抗病原菌感染的机制。对病原菌感染杂交體转录组测序获得14796个差异表达基因,其中4441个上调,10355个下调。RT-QPCR分析发现,感染后48h内CXC13、TLR5、IL-1、IL-6、TNF2和IFNy等非特异性免疫相关基因表达量显著升高,TCR、MHC-I和IgM等特异性相关基因表达量受到抑制,表明非特异性免疫反应发挥了重要作用,而病原菌抑制了部分特异性免疫应答。Tunel检测发现,感染后脾脏凋亡细胞明显增加,感染后48h细胞凋亡率(18.12%)显著高于感染前(0.63%);RT-QPCR检测发现,感染后凋亡相关因子TNFa、CASP3、CASP7和CASP8表达量均显著高于正常水平,推测病原菌通过TNF/TNFR1凋亡途径介导宿主细胞凋亡,促进了肉芽肿的形成。综合研究结果,推测舒伯特气单胞菌感染和肉芽肿结节形成的部分机制:病原菌通过鳃和肠入侵机体后,宿主中炎症细胞因子快速反应,激活、趋化中性粒细胞和巨噬细胞等聚集对病原菌吞噬。被吞噬的病原菌部分在巨噬细胞内存活,通过吞噬细胞(主要是巨噬细胞)转移到其它部位,诱导细胞凋亡、破裂,释放病原菌。肝、脾、肾等内脏组织内由于巨噬细胞较容易聚集,释放的病原菌也较多,成为了病原菌感染的主要器官。病原菌与吞噬细胞相互作用产生的大量凋亡细胞碎片和细菌刺激机体巨噬细胞上皮样化和纤维化包裹形成肉芽肿结节。形成的肉芽肿又作为庇护所和栖息地促进了病原菌的增殖和扩散。同时病原菌还通过抑制抗原递呈过程阻止宿主的部分特异性免疫应答,进一步对宿主进行感染。