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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族成员之一,可与死亡受体结合诱导细胞凋亡。与TNF家族的其他成员不同,TRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞毒性很轻,使得它可能成为很有前途的特异性抗肿瘤药物。然而,研究也发现癌细胞可通过多种机制呈现出对TRAIL的耐药,制约了其临床应用。因此,探索新的克服TRAIL耐药的途径具有重要临床价值。Ruxolitinib是一种JAK激酶抑制剂,具有抗肿瘤活性。我们前期的研究发现白血病细胞Kasumi一1亲本和TRAIL耐药细胞株呈现TRAIL显著耐药性,本研究将Ruxolitinib和TRAIL联合应用于Kasumi-1细胞,旨在寻找对t(8;21)阳性急性白血病新的治疗方法。研究工作分为两部分完成:第一部分Ruxolitinib和/或rsTRAIL对Kasumi-1细胞的体外作用。目的:观察rsTRAIL、Ruxolitinib单独及其联合对Kasumi-1细胞的体外作用。方法:采用WST-8(CCK-8)比色法测定rsTRAIL单药、Ruxolitinib单药及其联合应用对Kasumi-1细胞的生长抑制作用;采用DAPI染色法观察rsTRAIL单药、Ruxolitinib单药及其联合作用于Kasumi-1细胞后细胞凋亡状态;用流式细胞术检测rsTRAIL单药及二者联合作用于Kasumi-1细胞后细胞的凋亡率。结果:(1)rsTRAIL和Ruxolitinib在体外单用均可抑制Kasumi-1细胞的生长,luM和10uMRuxolitinib分别与不同浓度rsTRAIL联合用药可增加Kasumi-1细胞的生长抑制率,且呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。(2)DAPI染色发现单药和联合用药组细胞形态均出现胞体缩小和胞核固缩等显著变化,而联合用药组上述改变更为显著。(3)rsTRAIL(5ng/ml、10ng/ml)和Ruxolitinib(10uM)在体外单药及联合作用于Kasumi-1细胞,AnnexinV阳性细胞百分率分别为(30.62%±3.34%)(33.99%±3.67%)and(56.66%±4.23%)与对照组8.53%相比,差异显著(P<0.05)。结论:Ruxolitinib单独及联合rsTRAIL具有抑制Kasumi一1细胞生长作用且具有协同诱导Kasumi一1细胞凋亡的作用。第二部分Ruxolitinib体外增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡机制的研究。目的:探讨rsTRAIL、Ruxolitinib在体外单独及其联合诱导Kasumi-1细胞凋亡作用的机制。方法:采用实时定量PCR法检测不同浓度Ruxolitinib作用于Kasumi-1细胞,经不同作用时间后TRAIL及TRAIL受体DR4、DR5、DcR1及DcR2基因水平变化。WesternBlot法检测rsTRAIL、Ruxolitinib单独及联合作用于Kasumi-1细胞后,TRAIL受体及凋亡相关蛋白变化。应用siRNA干扰Kasumi-1细胞JAK2、 STAT3基因,WesternBlot法检测TRAIL受体DR4的蛋白水平变化。WesternBlot法检测不同浓度Ruxolitinib作用于Kasumi-1细胞48h和rsTRAIL、Ruxolitinib单独及联合作用于Kasumi-1细胞后对NF-KB活化水平的抑制。结果:(1)实时定量PCR法检测发现Ruxolitinib作用于Kasumi-1细胞,经不同作用时间后可以上调TRAIL及受体DR4、DR5、DcR1及DcR2基因水平。(2) Western Blot法检测Ruxolitinib、rsTRAIL单独及联合作用于Kasumi-1细胞后,TRAIL受体DR4蛋白水平升高,而DR5、DcR1及DcR2蛋白水平无明显变化。应用转染技术沉默JAK2和STAT3基因后,Western Blot检测发现DR4蛋白水平升高。(3)Western Blot法检测Ruxolitinib、rsTRAIL单独及联合作用于Kasumi-1细胞后,Caspase-8,-9无明显变化,Caspase-3蛋白水平升高,促凋亡蛋白Bax蛋白水平升高。(4)Western Blot法检测Ruxolitinib、rsTRAIL单独及联合作用于Kasumi-1细胞后, NF-KB活性受抑。结论:Ruxolitinib增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用的机制与DR4上调,激活Caspase-3,上调Bax和抑制NF-KB的活性有关。