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结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球罹患人数最多的三大癌症之一,对世界人民的健康造成相当大的危害。肠道微生物作为人体最庞大、最复杂的微生态系统,对人体健康有着深远的影响。正常生理状态下,肠道微生物处于动态平衡状态,但是这种平衡易受饮食、生活习惯、疾病、环境等因素影响,一旦这种平衡被打破,就会引起肠道微生物紊乱,进而造成CRC等相关疾病的发生,但其发病规律仍有待研究。CRC筛查可以通过在恶性转化之前,或早期检测和治疗CRC之前确定癌前病变来减少CRC的发生和死亡,然而,目前的早期筛查手段在提高CRC患者无病生存率方面进展甚微。结肠镜检查具有侵袭性,不被广泛接受;基于大便的无创筛查试验对大肠腺瘤的检测灵敏度较低,尤其是对早期腺瘤的筛查。因此,对早期CRC的筛查率依然很低,从而使得CRC的发生率和死亡率依然居高不下,所以一种对CRC早期和高风险腺瘤都敏感的非侵入性且经济的筛查手段有待探索。近年来,含有pks基因簇的基因毒性大肠杆菌(pks~+Escherichia coli,pks~+E.coli)因其在CRC的发生中发挥潜在作用而备受关注,但pks~+E.coli致CRC的机理尚不明确。本课题旨在研究CRC患者肠道菌群结构和术前术后的菌群变化规律,从中分离培养病原菌,并筛选pks~+E.coli作用于CRC小鼠以验证其对CRC发生发展的影响,为CRC早期诊断与手术预后提供研究依据。主要研究内容和实验结果如下:选取16位CRC患者,采集其手术前后的粪便,手术中的癌症组织和癌旁组织,分析其菌群组成及变化规律。从OTU数目、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数来看,患者与患者之间细菌多样性差异较大,部分患者多样性指数很低,手术后患者粪便中细菌多样性增加,癌旁组织中的多样性指数比较高,但是术前、术后粪便和癌症组织、距癌症2 cm、5 cm、10 cm癌旁组织样品的多样性指数的平均数没有明显差异。比较所有患者手术前后细菌群落结构,手术后粪便样品多样性高于手术前,手术后Enterobacteriacea和Ruminococcaceae的细菌丰度下降。比较所有患者癌症组织和癌旁组织中的细菌群落结构,发现在门的水平上没有显著差异;从属的水平来看,癌症组织和癌旁组织细菌群落组成存在差异,Acinetobacter、Pseudomonas和Sphingomonas等致病菌在癌旁组织中的比例较癌症组织低,且其含量随着与癌症组织的距离增大而减少。基于OTU的系统发育分析表明:样品中主要的细菌类别是E.coli,很多OTU的分类信息是公认的且会造成多器官感染的致病菌或条件致病菌。说明患者之间肠道微生物个体差异较大,不同患者具有各自特异性的肠道微生物;手术后患者肠道细菌组成与手术前有较大差异,癌症组织和癌旁组织细菌组成存在差异;CRC患者肠道中主要是致病菌和条件致病菌,与健康人的肠道菌群差异较大,因此防止CRC患者感染仍然非常重要。通过有氧培养从CRC患者癌症组织中分离培养到Enterobacteriaceae和Enterococcaceae的33株细菌,包括21株E.coli,9株Klebsiella pneumoniae,1株Klebsiella quasipneumoniae,2株Enterococcus faecalis。联合使用轻便型气密隔离手套操作箱、厌氧产气袋、密封培养罐、密封培养袋等简易器材制备无氧环境,分离培养到Enterobacteriaceae、Enterococcaceae和Streptococcaceae的28株细菌,包括12株E.coli,10株K.pneumoniae,1株K.quasipneumoniae,2株E.faecalis,3株Streptococcus anginosus。使用pks基因组岛检测引物clb Q、clb A、clb B对本实验从CRC癌症组织中分离的21株好氧E.coli、12株厌氧E.coli和2017年实验组从CRC患者粪便中分离的19株好氧E.coli进行PCR扩增,筛选出厌氧菌株crc2-6和好氧菌株CRC3-6为pks~+E.coli菌株。通过一次性腹腔注射氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM),并联合葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)三循环饲喂,构建基于结肠炎的CRC小鼠模型。建模过程中,给实验组小鼠灌喂pks~+E.coli crc2-6活菌菌悬液,对照组灌喂生理盐水。与对照组相比,crc2-6处理的实验组小鼠肠道炎症加重,结直肠肠壁增厚,肠粘膜还出现非常明显的皱缩,小鼠体重明显下降,存活率降低,肠道病症加重。组织病理学检查结果也显示,crc2-6处理后小鼠癌变进度加快,癌变细胞数量明显增多,Ki-67和PCNA阳性细胞检出率显著升高。表明pks~+E.coli crc2-6菌株在一定程度上会促进结直肠炎症,进而促进CRC的发生发展。