精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)是具有自我更新与分化潜能且可将自身基因稳定传递给下一代的成体干细胞。随着SSCs移植技术的出现,人们对SSCs生物学功能与应用的研究已成为一新的研究热点。鼠类相关研究结果显示利用SSCs移植法制备转基因动物具有较多优点,如取材方便、体外操作过程中细胞系更为稳定以及转基因效率相对较高等。SSCs移植法制备转基因动物的成功主要取决于以下几个因素：1、SSCs的体外培养技术与基因修饰方法；2、在保证受体微环境不受破坏的前提下,最大限度去除内源性SSCs的受体制备技术；3、适合某一特定物种的SSCs移植方法。本文主要以大鼠为研究对象,以本实验组已建立的SSCs体外长期培养技术为基础,从基因修饰、受体制备以及SSCs移植方法等方面探讨SSCs移植法制备转基因大鼠的具体方法。1.大鼠SSCs的培养与基因修饰本研究以本实验组已建立的大鼠SSCs体外长期培养技术为基础,探讨适合用慢病毒对大鼠SSCs进行基因修饰的方法。我们对冻存的大鼠SSCs进行了复苏培养,用免疫荧光染色的方法对大鼠SSCs进行鉴定,以保证所用SSCs的特性没有发生改变。本研究用携带EGFP报告基因的慢病毒对大鼠精原干细胞进行基因修饰。首先,通过在慢病毒感染后第6小时到第15小时之间,每隔2小时对大鼠SSCs与滋养层细胞进行形态观察的方法初步判定了该慢病毒作用于大鼠SSCs的最佳作用时间。以此为基础,采用MOI=5、 MOI=10、M0I=30、MOI=60四个感染剂量,用慢病毒分别感染体外培养的大鼠SSCs。24与48小时后,通过倒置荧光显微镜观察被感染SSCs的形态与绿色荧光蛋白表达情况,得到了该慢病毒感染大鼠SSCs的最佳感染剂量。以上研究为进一步用SSCs移植法制备转基因大鼠提供了保障。2.孕鼠注射白消安法制备大鼠精原干细胞移植受体SSCs移植的成功很大程度上依赖于受体。为了能给外源的供体SSCs提供足够的内环境而使其在曲细精管基底膜上定居,一个合格的SSCs移植受体会在保持内环境不被破坏的前提下最大限度地去除内源性SSCs及各级生精细胞。尽管白消安法已成为制备SSCs移植受体的常用方法之一,在大鼠中,我们仍然需要进一步探讨更为有效的制备SSCs移植受体的方法。我们选取了怀孕13.5天的雌性大鼠作为研究对象,分别对其注射7.5mg/kg.10mg/kg.12.5mg/kg白消安,探讨不同剂量白消安对其子代的影响,以期寻找到更为高效的大鼠SSCs移植受体制备方法。通过研究我们发现对孕鼠注射12.5mg/kg白消安会导致子代全部流产或死亡,说明大鼠对这一剂量的白消安过为敏感,因此后续的实验仅在7.5mg/kg与10mg/kg组之间进行。我们对该两组孕鼠的雄性后代进行了如下方面的检测：睾丸重量的变化、睾丸组织形态学变化、睾丸中不同细胞特异表达基因的实时定量PCR检测以及生育能力的检测。通过以上比较我们得出了如下结论：7.5mg/kg处理组尽管在一定时期内消除了其雄性后代的内源性SSCs,但此种情况只能在较短时间内得到维持,因此,该处理条件不适合用来制备大鼠SSCs移植受体。10mg/kg的处理组因既可以维持后代的健康生存又可以最大限度的去除内源性SSCs同时还维持了支持细胞的正常水平而成为制备SSCs移植受体的最佳选择。3.大鼠精原干细胞移植方法的建立1994年Brinster等在小鼠中开创了SSCs移植技术,受到了人们的广泛关注。除了对精子发生的研究起到重要的促进作用,SSCs移植同样也是一项具有重要应用价值的技术手段。主要在如下几个方面产生重要影响：1、保存生育能力；2、治疗雄性不育；3、转基因动物的制备。除供体的准备与受体制备对干细胞移植的成功具有重要影响外,移植方法也对移植结果具有重要影响。尽管已有很多研究讨论了小鼠的SSCs移植方法,但由于大鼠睾丸与小鼠睾丸具有某些不同的解剖结构,故针对大鼠的SSCs移植方法还有待于更为深入的探究。本研究从注射针的制备方法与睾丸网显微注射法两个方面入手,总结出了一套行之有效的大鼠SSCs移植方法,并结合本论文中已讨论的慢病毒感染SSCs方法与大鼠SSCs移植受体制备方法对8只受体大鼠进行了SSCs移植,移植成功率为87.5%。4.检测生精过程中减数分裂完成的载体的构建在成年雄性哺乳动物体内,精子发生过程是一个高度调控的极其复杂的过程。在成年睾丸曲细精管中的SSCs经历有丝分裂、减数分裂以及形态上的剧烈改变而分化为成熟精子。目前对精子发生过程的体外研究手段还不成熟,对生精过程重要事件的发生缺乏精确的鉴定标准,因此需要通过基因工程的手段引进分子标记。由Gsg2基因所表达的Haspin蛋白可以检测到精子发生过程中减数分裂的完成。本研究旨在构建在所有转染细胞中表达绿荧光,在核分裂的次级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中表达红色荧光蛋白的CMV-eGFP-Gsg2-DsRed载体,为进一步结合大鼠SSCs体外培养与修饰技术、大鼠SSCs受体制备技术以及大鼠SSCs移植技术,制备成功表达该载体所携带基因的转基因大鼠做准备。重组载体是以本实验组保存的CMV-eGFP-DsRed质粒载体为基础载体,在其多克隆位点插入Gsg2启动子,期待红荧光蛋白基因在次级精母细胞后的生殖细胞中表达。经小鼠睾丸共培养细胞转染实验证实,本实验成功构建了含有Gsg2和CMV双启动子分别表达红荧光和绿荧光双荧光蛋白的质粒载体。这个载体为直观检测精子发生过程中减数分裂完成的转基因大鼠模型的制作提供了基础。