论文部分内容阅读
研究目的1.研究小细胞肺癌细胞系肿瘤干细胞中HIFs有无表达及其意义。2.研究小细胞肺癌肿瘤组织中HIFs的表达及其临床病理意义。研究方法1.利用干细胞无血清培养技术,富集小细胞肺癌细胞系H446第三代肿瘤球细胞作为肿瘤干细胞。2.采用实时荧光定量PCR方法,检测小细胞肺癌细胞系H446肿瘤球细胞和亲代细胞中HIF-1α和HIF-2α的mRNA表达。3.进一步采用实时荧光定量PCR方法,检测HIF-2α调控的靶基因OCT-4及其它干细胞相关基因SOX2、c-Myc和NONOG的mRNA表达。4.采用免疫荧光染色方法,检测小细胞肺癌细胞系H446肿瘤球细胞和亲代细胞中HIF-1α、HIF-2α和OCT-4的蛋白表达。5.通过免疫组化染色方法,检测45例小细胞肺癌组织中HIF-1α和HIF-2α的表达并分析其临床病理意义。6.采用Spearman秩相关方法,分析HIF-1α和HIF-2α的表达与小细胞肺癌干细胞标记物uPAR的相关性。7.采用Kaplan-Meier方法进行单因素分析,再将单因素回归分析中有统计学意义的变量进行Cox比例风险回归模型的多因素分析。结果1.小细胞肺癌肿瘤干细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达(1)本课题组前期工作证明小细胞肺癌细胞系H446第三代肿瘤球细胞富集肿瘤干细胞,本研究以第三代肿瘤球细胞作为肿瘤干细胞。实时荧光定量PCR结果显示：与亲代细胞相比,肿瘤球细胞HIF-2α的nRNA表达水平上调(P<0.05),相反,HIF-1α的mRNA表达水平下调(P<0.05),提示HIF-1α和HIF-2α的mRNA表达水平呈互补特征。(2)进一步检测HIF-2α的靶基因OCT-4及干细胞相关基因在肿瘤球细胞中的表达,结果显示：与亲代细胞相比,肿瘤球细胞OCT-4的mRNA表达水平上调(P<0.05),而SOX2、c-Myc和NONOG的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(3)免疫荧光染色结果显示：肿瘤球细胞中,HIF-2α呈现阳性表达,而HIF-1α呈弱阳表达甚至阴性；相反,亲代细胞中,HIF-2α呈弱阳表达甚至阴性,而HIF-1α呈阳性表达,提示HIF-1α和HIF-2α的蛋白表达也呈互补特征。2.小细胞肺癌肿瘤组织中HIF-1α和HIF-2α的表达及其临床意义(1)小细胞肺癌肿瘤组织中HIF-1α的阳性表达率为48.9%(22/45),癌旁正常组织中无HIF-1α表达；HIF-1α阳性表达产物主要定位于肿瘤细胞胞核,阳性细胞散在分布于癌巢。HIF-2α的阳性表达率为24.4%(11/45),癌旁正常组织中无HIF-2α表达；HIF-2α阳性表达产物主要定位于肿瘤细胞胞核,阳性细胞主要分布于肿瘤坏死组织周围区域。肿瘤间质细胞中,一小部分形态上确定为肿瘤相关巨噬细胞中亦可见HIF-2α表达。(2)HIF-1α和HIF-2α的表达与小细胞肺癌干细胞标记物uPAR(前期研究结果)的Spearman相关分析显示：HIF-1α与uPAR表达无相关性(P=0.183,r=0.202),但HIF-2α与uPAR的表达呈显著正相关(P=0.001,r=0.497)。为了进一步弄清HIF-2α和uPAR在小细胞肺癌组织的表达定位是否也具相关性,我们进行HIF-2α和uPAR的免疫组化连续切片染色,结果显示：HIF-2α与uPAR在某种程度上共同表达于小细胞肺癌组织坏死周围区域,尽管HIF-2α阳性细胞与uPAR阳性细胞没有完全重叠。(3)HIF-2α的表达与小细胞肺癌肿瘤大小和远处转移密切相关：随着肿瘤体积的增大,HIF-2α的表达随之增高(P<0.05),HIF-2α阳性组患者远处转移率高于HIF-2α阴性组(P<0.05)。但是HIF-1α的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、胸膜侵袭和远处转移无明确统计学意义(P>0.05)。(4)单因素分析结果显示小细胞肺癌患者生存时间缩短与HIF-1α、HIF-2α、年龄和远处转移有关。但将单因素分析中有统计学意义的变量进行多因素分析,结果表明只有HIF-2α和远处转移能作为小细胞肺癌独立预后因素。结论1.小细胞肺癌细胞系H446肿瘤干细胞中HIF-1α和HIF-2α均有表达,但HIF-2α表达水平上调,HIF-1α表达水平反而下调,提示两者的表达呈互补特征。2.小细胞肺癌肿瘤组织HIF-1α和HIF-2α均有表达,但HIF-2α的阳性率低于HIF-1α,癌旁正常组织中两者均无表达。3.HIF-2α的表达可能与小细胞肺癌干细胞相关。4.HIF-2α的表达与肿瘤生长和远处转移有关,可作为患者独立的预后因素。总之,小细胞肺癌肿瘤干细胞HIF-2α的表达上调,其表达可能代表小细胞肺癌更加恶性的肿瘤行为。