【摘 要】
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目的:结合单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠模型和转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞HK-2模型构建体内外肾纤维化模型,探讨尿石素B对肾纤维化大鼠的改善作用及机制研究。方法:（1）将正常健康大鼠随机分为6组（n=18）,分别为正常对照组,UUO模型组,尿石素B高、中、
【基金项目】
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国家自然科学基金:基于活性导向思路和代谢组学技术研究鞣花鞣质代谢物Urolithins的化学修饰及其代谢转运与调控（项目编号:31770381）；
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目的:结合单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠模型和转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞HK-2模型构建体内外肾纤维化模型,探讨尿石素B对肾纤维化大鼠的改善作用及机制研究。方法:（1）将正常健康大鼠随机分为6组（n=18）,分别为正常对照组,UUO模型组,尿石素B高、中、低剂量组(80,40,20 mg·kg-1),阳性对照组依那普利组(20 mg·kg-1),除正常对照组外,其余各组给予单侧输尿管梗阻模型方法处理。手术后第二天给药组均灌胃给予阳性药依那普利和尿石素B干预,正常对照组和模型组灌胃给予等量的生理盐水。分别于手术后7d,14d,21d随机抓取各组6只大鼠收集其尿液、血清和肾组织,检测各组尿蛋白,血清Cr和BUN,肾脏指数的变化。肾组织行HE和Masson染色,观察各组肾组织病理学特征。ELISA法测各组血清中炎症因子TNF-α和IL-6的浓度,分别应用免疫组化和免疫荧光技术检测肾组织中单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoatttractant protein-1,MCP-1）和alpha-SMA的表达量,此外,RT-PCR检测肾组织中促纤维化因子和炎症因子TGF-β1,NF-κB,COL-IV,TNF-α,IL-6和MCP-1的表达,同时,采用Western blot检测各组肾组织中TGF-β1,Smad2,Smad3,TLR4、NF-κB p65、P-IKKα和TRAF6蛋白的表达水平。（2）体外培养HK-2细胞,并分为正常对照组,TGF-β1诱导组,尿石素B高,中,低剂量组(60,30,15μg·ml-1),10ng·ml-1TGF-β1诱导24h后,采用CCK-8法检测尿石素B对TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖的影响以及Western blot法检测细胞中TGF-β1,Smad3,p-Smad2/3,Smad7,NFκBp65,,P-IκBα和IκBα蛋白表达水平。结果:（1）UUO组大鼠在手术7d后,肾脏体积,肾脏指数,尿蛋白,血清Cr和BUN均显著性升高（p＜0.05）,尿石素B干预后均显著性下调了（p＜0.05）。观察HE和Masson染色发现,UUO组大鼠系膜内基质大量增生聚集,肾小球基底膜增厚,体积变大,肾小管和集合管萎缩,炎细胞大量浸润,胶原纤维大量表达,ECM大量沉积。与模型组相比,尿石素B干预组ECM沉积显著减少,肾小球和肾小管损伤程度减小。（2）UUO组大鼠炎症因子TNF-α,IL-6和MCP-1浓度显著升高（p＜0.05）,与UUO组相比,尿石素B干预组明显下调（p＜0.05）;免疫荧光结果显示UUO组alpha-SMA在肾小管,肾小球中大量表达（p＜0.05）,尿石素B干预后,显著性降低;RT-PCR结果表明,UUO组纤维化因子和炎症因子TGF-β1,NF-κB,COL-IV,TNF-α,IL-6和MCP-1的表达显著性上调（p＜0.05）,与UUO组相比,尿石素B干预组均明显下调（p＜0.05）;Western Blot检测结果发现,UUO组TGF-β1,Smad2,Smad3,TLR4、NF-κB p65、P-IKKα和TRAF6蛋白表达均显著升高（p＜0.05）,与UUO组相比,尿石素B给药组均显著下调（p＜0.05）。（3）细胞增殖检测结果显示（CCK-8法）,正常HK-2细胞给予TGF-β1诱导后其生长活力较空白组细胞显著性升高（p＜0.05）,同时尿石素B作用后,细胞生长速度受到明显的抑制（p＜0.05）;与此同时TGF-β1诱导后,电镜下观察到正常HK-2细胞形态由鹅卵石状转变为长梭性,尿石素B组细胞形态得到显著好转;Western blot结果表明,与正常对照组相比,TGF-β1诱导组TGF-β1,Smad3,p-Smad2/3,NFκBp65和P-IκBα蛋白表达显著性升高,Samd7和IκBα蛋白表达显著性降低（p＜0.05）;尿石素B干预后,上述蛋白表达均显著性下调了,Samd7和IκBα蛋白表达上调了（p＜0.05）。结论:尿石素B干预UUO诱导的肾纤维化大鼠和TGF-β1诱导的HK-2细胞能显著性抑制炎症因子和促纤维化因子的表达,且可能是通过抑制TGF-β1/Smad和TLR4/NF-κB信号通路,对肾纤维化表现出良好的保护作用。该研究为慢性肾脏疾病的预防和治疗提供了新的膳食措施。
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