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研究背景:间充质干细胞作为肝纤维化治疗的一种新疗法被提出,本研究团队前期研究结果显示骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)可以降低四氯化碳诱导的Sprague-Dawley(SD)大鼠的肝纤维化发展。但是只有少数MSCs可以归巢到损伤的肝脏,而且可以分化为功能性肝细胞的数量更少。因此我们推测BM-MSC发挥作用主要是通过其旁分泌机制。本文主要研究间充质干细胞条件培养基(MSC-conditioned medium,MSC-CM)对肝纤维化是否有保护作用及其作用机制。研究方法:购买六周龄雄性SD大鼠(清洁级)随机分为三组(每组n=8):模型组(CCL4-对照组);治疗组(CCL4+MSC-CM);正常对照组。肝纤维化模型的建立:将CCL4和橄榄油按照1:1体积混合,以1.5ml/kg的剂量腹腔注射,每周2次,共持续8周。BM-MSC培养至3-5代用于MSC-CM的制备,获取的MSC-CM进行超滤浓缩(3KD)约25倍,过滤除菌。在实验第5周起,治疗组尾静脉注射MSC-CM,剂量为2mg/kg,每天1次至第8周末,同时模型组和正常组注射相同剂量的L-DMEM。待实验终点,第8周末,部分大鼠提取肝脏进行组织病理学分析,剩余大鼠按照原位灌注法依次灌注前灌注液、PronaseE溶液、CollagenaseIV溶液,并且经过密度梯度离心提取肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)进行进一步研究。本实验过程中采取大鼠静脉血,检测ALT、AST、TBIL、ALB水平。胶原纤维沉积的程度通过Masson染色检测,使用免疫组织化学染色法来测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达程度。qRT-PCR和western blot 检测 HSC 中α-SMA、转化生长因子1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、解偶联蛋白 2(Uncoupling protein 2,UCP2)、基质金属蛋白酶 2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2)基因和蛋白的表达水平。研究结果:1.肝功能结果分析显示,治疗组中ALT、AST、TBIL水平均较模型组有明显降低,尤其TBIL在第五周有统计学意义。2.肝组织病理学分析显示:HE染色提示模型组汇管区出现重度碎片状坏死、纤维间隔,形成肝硬化(G3S4),治疗组汇管区细胞坏死程度和炎症细胞浸润程度(G2S1)较模型组明显减轻;Masson染色显示模型组胶原纤维大量沉积,治疗组胶原纤维沉积程度较模型组明显降低(P<0.05);免疫组织化学染色显示治疗组肝组织窦周α-SMA表达量明显低于模型组(P<0.05)。这提示MSC-CM可以改善纤维化肝组织病理学表现。3.HSC相关指标分析结果显示:治疗组中α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ在基因和蛋白水平表达量明显低于模型组(P<0.05),UCP2在基因和蛋白水平的表达量明显高于模型组(P<0.05),提示MSC-CM治疗后可以降低HSCs的活化;MSC-CM可升高HSC中MMP-2的表达,促进胶原降解。结论:1.长期小剂量CCL4腹腔注射可诱导典型的肝纤维化,通过尾静脉注射MSC-CM进行干预,可以减轻肝脏炎性细胞浸润,抑制肝纤维化形成。2.MSC-CM通过抑制HSC的活化治疗肝纤维化:1)MSC-CM通过下调TGF-β1的表达和上调UCP2的表达抑制HSC活化;2)MSC-CM可升高HSC中MMP-2的表达促进Ⅰ型胶原降解。