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环己胺作为一种重要的精细化工中间体,给大气和水体带来了严重的污染,该化合物还具有一定的致癌性。Pseudomonas plecoglossicida NyZ12是一株能利用环己胺为唯一碳源、氮源和能源生长的菌株,其环己胺代谢的分子生物学机理仍未阐述清楚。本实验室在前期研究假单胞菌NyZ12中环己胺的降解途径中,将amo2631克隆到广宿主表达载体pVLT33,在假单胞菌PaW340中表达和纯化,最终成功得到amo2631所表达蛋白,在其转化的过程中,也成功检测到产物环己酮的生成,验证了该基因的功能。然而,采用无痕敲除技术敲除了amo2631后,突变体仍然能够以环己胺为唯一碳氮源良好的生长,仅生长速率受到了一定的影响,表明了该菌株在环己胺的初始代谢步骤中存在代谢冗余机制,即可能含有两个或两个以上的基因共同完成环己胺到环己酮的代谢过程。本论文的目的在于探究环己胺的初始代谢步骤的冗余基因,充分揭示假单胞菌NyZ12代谢环己胺的分子机理。为了达到该目的,采用了生物信息学分析、基因组建库筛选和转座子插入突变体库三种方式筛选环己胺降解相关基因,得到了基因 orf671、orf5356、orf566,orf567以及基因族 orflNl2(orf566、orf567)、四基因簇 orfN4(orf1725、orf1727、orf1728、orf1729)。将上述预测基因克隆至pUC18载体后,全细胞转化使用分光光度计法检测底物环己胺的降解情况,其中orf566和orf671降解较明显,将其克隆至pET表达载体,于BL21(DE3)菌株中诱导表达,并纯化蛋白:将粗酶液进行环己胺底物转化,并用GC-MS检测产物,其中orf671转化产物中成功检测到代谢中间产物环己酮(保留时间3.300min),证明了 为环己胺初始代谢步骤的参与基因之一,其作用机理有待后序研究。而orfN4由于基因片段较大,在pUC18与pET28b表达均难有效表达,故考虑直接无痕敲出。将主要基因orf1727在amo2631突变体NyZ12△4的基础上进行敲除,结果表明,NyZ12△5未失去以环己胺为唯一碳氮源生长的特性,但生长速率明显慢于NyZ12A4,故基因orf1727可能为环己胺代谢相关基因,有待后续研究进一步证实。另外,本论文克隆和异源表达来源于不动杆菌YT-02的环己胺氧化酶,并对其酶学性质进行了研究,该酶分子为二聚体蛋白,分子量约为91 kDa,该酶的最适温度为50℃。但是,该酶是不耐热的,50℃孵育30min后其活性丧失。金属离子Mg2+,Co2+和K+对酶活性具有一定的抑制作用。动力学参数Km和Vmax分别为 0.25±0.02 mM 和 4.3±0.083 μM min-1。