论文部分内容阅读
蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一种烈性非接触性传染病。BTV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Obivirus)蓝舌病病毒亚群,主要侵害纯种细毛羊。该病毒是由10个片段组成的双股RNA病毒,共编码7种结构蛋白(VP1~VP7)和5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a、NS4)。其中VP7蛋白携带群特异性抗原决定簇,至少含有6个线性抗原表位,通过对不同血清型VP7蛋白的氨基酸序列比对得出,30~48位氨基酸残基的序列同源性为100%,证明VP7蛋白为高度保守的蛋白,具有群特异性,是BTV抗体检测的理想抗原。施马伦贝格病是由施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)引起的经库蠓传播的一种新型病毒性传染病。SBV是由3个片段组成的单股负链RNA,属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波血清群病毒(Simbusero group viruses),此病蔓延于西欧大部分地区,我国目前尚未出现此病。在施马伦贝格病毒编码的蛋白中,核衣壳N蛋白抗原性最强,因此N蛋白成为研究热点。本研究为了建立BTV-VP7 ELISA检测方法,根据GenBank中BTV 25型毒株的VP7基因序列(登录号EU839843.1)设计一对引物,以含VP7基因的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增出BTV 25型毒株的VP7目的基因,克隆至pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经核苷酸序列测定,将正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达纯化His-BTV-VP7蛋白,以此蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定表明,VP7蛋白以包涵体形式表达,分子量大小与预期相符。ELISA优化结果表明,抗原80倍稀释、山羊阳性血清400倍稀释、HRP标记的驴抗山羊IgG 5000倍稀释为最佳稀释度。利用该方法与IDEXX蓝舌病毒VP7抗体检测试剂盒检测结果对比,二者一致性超过94%;检测其他4种病毒阳性血清,结果均为阴性。说明建立的此法敏感性高、特异性强可以用于蓝舌病的流行病学调查,且成本低。由于施马伦贝格病毒是外来病毒,我国尚未出现此病毒株,也没有出现感染病例,所以本研究为了建立SBV-N ELISA检测方法,根据GenBank公布的SBV(BH80/11-4)碱基序列,利用基因合成的方法获得SBV-N蛋白的基因,克隆至pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-SBV-N重组质粒。经核苷酸序列测定,将正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达纯化His-SBV-N蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot分析得出,重组N蛋白以包涵体形式表达,分子量为26 KD与预期相符且与单克隆抗体2C8发生特异性反应。用此纯化N蛋白作为包被抗原,用其针对的单克隆抗体2C8作为一抗,建立ELISA检测方法结果表明,抗原640倍稀释、一抗100倍稀释、HRP标记的驴抗鼠IgG 5000倍稀释为最佳稀释度,检测其他4种病毒的阳性血清,结果均为阴性。证明此方法特异性、敏感性均强,可用来施马伦贝格病的流行病学调查。