脑缺血是一种临床常见病,具有高发病率,高致残率和高死亡率等特点,已成为威胁我国社会群体健康的多发疾病。流行病学研究显示,我国现存缺血性脑血管病患者约490余万人,其中约60-75%的存活者存在不同程度的劳动力障碍,给家庭及社会造成了沉重的负担。因此,针对脑缺血的发病机制及其干预因素进行进一步的研究,将有助于更有效的防治脑缺血。脑缺血后5-羟色胺(5-HT)大量释放,其强烈的缩血管作用被认为是脑缺血后脑血管痉挛、血流障碍的主要原因。寻找一种能够通过阻断5-羟色胺引起的大脑动脉收缩、痉挛的药物,发挥对脑血管的选择性扩张,可望有效防止脑缺血所致的脑水肿,缩小脑梗死范围作用,具有十分重要的意义。左旋氨氯地平是一种长效二氢吡啶类钙离子拮抗剂,主要作用于细胞膜上的L型钙通道,阻断Ca2+-依赖性蛋白激酶途径,降低细胞浆内Ca2+浓度,引起血管舒张。研究发现左旋氨氯地平能扩张正常和缺血区的冠状动脉及冠状小动脉,使冠状动脉痉挛病人心肌供氧增加。左旋氨氯地平能否阻断Ca2+-依赖性蛋白激酶途径,抑制脑缺血后5-HT引起的大脑动脉痉挛、收缩,发挥改善脑缺血血供?目前尚无相关研究。已有实验证实,无论有无氧气存在,5-羟色胺均可浓度依赖性地引起大鼠脑动脉的收缩,而缺氧状态下,5-羟色胺对脑动脉的收缩作用增强。本实验通过研究左旋氨氯地平对缺氧离体大鼠基底动脉收缩作用的抑制,以了解其“抗脑血管痉挛”的潜在价值。本研究通过比较不同浓度的左旋氨氯地平对缺氧状态下5-HT预收缩的离体大鼠基底动脉直径的影响,以了解左旋氨氯地平对正常及缺血区脑血管的扩张作用。初步观察左旋氨氯地平对大鼠基底动脉的舒张与钙通道、内皮舒张因子的关系,获得左旋氨氯地平的舒张大鼠基底动脉的机制,可望为脑缺血的发病机制和治疗研究提供实验依据。目的1、观察缺氧状态下不同浓度的左旋氨氯地平对5-HT预收缩的离体大鼠基底动脉直径的影响,以探讨左旋氨氯地平对大鼠基底动脉缺氧性舒张的影响；2、通过比较左旋氨氯地平对5-HT预收缩内皮完整/去内皮血管的抑制作用,以及比较内皮舒张因子抑制剂L-NAME (NO合酶抑制剂)对左旋氨氯地平舒张内皮完整血管作用的影响,了解左旋氨氯地平对缺氧状态下大基底动脉的舒张作用与钙通道、内皮舒张因子NO的关系,从而探讨左旋氨氯地平的舒张大脑动脉机制。方法1离体大鼠基底动脉标本的制备称重后SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉后,钝性分离出大鼠基底动脉,整理后固定与血管张力系统的传感器的触角上,官腔内灌流着PSS液。将取材血管分为去血管内皮组和内皮完整组,去血管内皮组采用低离子强度营养液灌注法将取材血管去除内皮,实验期间持续向浴槽内通入混合气体,依实验目的不同在常氧时通入95%02+5%C02混合气体,缺氧时通入95%N2+5%CO2混合气体。2血管稳定性试验将内皮完整血管组(n=6)和去内皮血管组(n=6)分别固定于血管张力测定系统上,在浴槽内充分灌流PSS液。当血管直径不发生明显改变时,记录此时的直径大小为0 min时的测定值D0；再将液体全部替换为K+-PSS,血管稳定后,记录此时的直径大小为测定值Dk1；然后再重新替换为PSS液灌流,记录血管在无任何外界刺激的情况下灌流30 min和60 min时的直径测定值(分别为D30、D60)；并且在再在灌流60 min后将液体全部替换为K+-PSS,记录此时的血管直径为测定值Dk2。比较常氧状态下各个时间点基底动脉的直径变化,以了解其稳定性和持续时间。3左旋氨氯地平对5-HT所致缺氧基底动脉收缩的抑制作用浴槽内持续通以95%N2+5%C02混合气,待血管稳定后向浴槽内加入终浓度为5×10-7 mol/L的5-HT,使血管产生稳定收缩状态,记录此时血管的直径为Ti值,然后向浴槽内分别灌流浓度为10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、 10-7mol/L,10-6mol/L、10-5mol/L、10-4,ol/L或10-3mol/L的左旋氨氯地平15 min,观察不同浓度的左旋氨氯地平(10-8～10-3mol/L)对血管收缩幅度的影响,记录血管收缩稳定时的直径为To值。以未灌流左旋氨氯地平时5-HT预收缩血管的幅度为100%,按如下公式分别计算不同浓度左旋氨氯地平对5-HT预收缩血管作用的抑制百分率(%)：(Ti-To)/Ti×100%。以左旋氨氯地平对数浓度为横坐标、以抑制百分率为纵坐标绘制量效曲线。4左旋氨氯地平的舒血管作用与钙通道的关系研究血管活性检验、去内皮检验合格后,浴槽内持续通以95%N2+5%C02混合气体,待血管稳定后向浴槽内加入终浓度为5×10-7 mol/L的5-HT,使血管产生稳定收缩状态,记录此时血管的直径为Ti值,然后向浴槽内分别灌流浓度为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L,或10-3mol/L的左旋氨氯地平15min,记录血管收缩稳定时的直径为To值。以未灌流左旋氨氯地平时5-HT预收缩血管的幅度为100%,按如下公式分别计算不同浓度左旋氨氯地平对5-HT预收缩血管作用的抑制百分率(%):(Ti-T0)/Ti×100%。5左旋氨氯地平舒血管作用与内皮舒张因子NO的关系研究在血管完成稳定性和内皮完整性检测后,浴槽内持续通以常氧状态下的95%02+5%CO2混合气体,待血管稳定后向浴槽内加入终浓度为5×10-7 mol/L的5-HT,使血管产生稳定收缩状态,记录此时血管的直径为T0值。然后向浴槽灌流浓度为10-4 mol/L左旋氨氯地平15 min后,记录血管收缩稳定时的直径为T1值；之后向浴槽内灌流浓度为10-4mol/L L-NAME液,孵育30 min分钟后,记录血管收缩稳定时的直径为T2值。以未灌流左旋氨氯地平时5-HT预收缩血管的幅度为100%,按如下公式分别计算L-NAME灌流前后对左旋氨氯地平舒张血管作用的抑制百分率(%):(T0-T1)/T0×100%和(T0-T2)/T0×100%。为了解缺氧条件下左旋氨氯地平对5-HT所致的血管收缩的抑制作用与内皮舒张因子的关系,在浴槽内改通入95%N2+5%CO2混合气体,并重复上述试验。6统计方法采用SPSS13.0进行结果分析。左旋氨氯地平的舒张作用以5×10-7mol/L5-HT诱发的收缩幅度作为100%,分别计算出各种条件下不同浓度左旋氨氯地平对5-HT收缩血管作用的抑制百分率,所有结果均以均数±标准差表示,用两样本t检验进行显著性差异检验,以P<0.05作为判断差别有统计学意义的标准。结果1、离体基底动脉的稳定性实验结果：为了解实验血管在离体条件下的稳定性和持续时间,我们测定了内皮完整和去内皮血管在PSS持续灌流后不同时间点的血管直径。两组血管在持续以常氧PSS灌流30min、60min时血管直径变化与灌流前(D0)无明显差异(P>0.05)。两组血管分别间隔1h先后两次给予高K+-PSS液后,血管直径的收缩幅度相对于血管初期(D0)的血管直径有显著收缩(P<0.05),但二者之间无显著性差别(P>0.05)。说明在离体条件下,大鼠基底动脉直径较为稳定,不产生明显变化,且反应活性保持良好,至少可维持60min。2、左旋氨氯地平对5-HT所致缺氧离体大鼠基底动脉收缩的抑制作用本实验研究左旋氨氯地平对缺氧离体大鼠基底动脉收缩作用的抑制,以了解其“抗脑血管痉挛”的潜在价值。以未灌流左旋氨氯地平时5×10-75-HT收缩血管的幅度为100%,计算不同浓度(10-10～10-3 mol/L)左旋氨氯地平对5-HT收缩血管作用的抑制百分率分别为：0.0436±0.0116%、0.0530±0.0134%、0.0696±0.0103%、0.1265±0.0284%、0.2362±0.0275%、0.4084±0.0260%、0.5185±0.0238%、0.5358±0.0160%。实验表明,左旋氨氯地平对缺氧条件下5-HT预收缩的血管有明显的抑制作用,且呈明显的浓度依赖性。3、左旋氨氯地平舒血管作用与钙通道的关系以未灌流左旋氨氯地平时5×10-7 mol/L 5-HT收缩血管的幅度为100%,不同浓度(10-8～10-3mol/L)左旋氨氯地平对5-HT收缩去内皮血管作用的抑制百分率分别为(%)：0.0607±0.0084、0.0852±0.0138、0.1676±0.0247、0.3285±0.0250、0.4161±0.284、0.4219±0.260。实验表明,左旋氨氯地平对缺氧条件下5-HT预收缩的内皮完整血管的抑制作用显著大于左旋氨氯地平对5-HT预收缩的去内皮血管的抑制作用(P<0.05),提示左旋氨氯地平可能通过阻滞受体操控型钙离子通道而发挥舒血管活性。4、左旋氨氯地平舒血管作用与内皮舒张因子NO的关系以5-HT收缩血管的幅度为100%,未孵育L-NAME前10-4mol/L左旋氨氯地平对5-HT预收缩血管的抑制率为0.9626±0.0224%；孵育L-NAME后左旋氨氯地平对5-HT预收缩血管的抑制率为0.7358±0.0149%；在缺氧状态下在孵育L-NAME前后10-4mol/L左旋氨氯地平对5-HT预收缩血管的抑制率分别为0.9485±0.0129%和0.8979±0.0150%。经统计学处理,无论常氧或缺氧状态下,L-NAME均可显著降低左旋氨氯地平舒张血管的作用(P<,0.05)。提示左旋氨氯地平对脑血管的舒张作用除了受体操控型钙离子通道外,可能还与内皮的舒张因子有关。结论脑缺血后5-羟色胺引起的血管收缩,可被钙通道拮抗剂左旋氨氯地平拮抗,提示可能与通过阻滞受体操控型钙离子通道、内皮舒张因子NO的释放有关。这提醒了我们,左旋氨氯地平不仅作为传统高血压药物在临床广泛应用,其还可能作为与5-羟色胺升高有关的脑血管疾病治疗药物的潜在价值。