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目的:通过对本院2015-2020年初发AML患者临床样本的收集,回顾性分析了伴有TP53截短突变的AML患者的临床特征及其预后意义,并且从细胞水平对Δ107p53这一新型p53截短体的生物学功能进行研究,以期探讨p53截短体对AML患者的影响,进而为AML患者的个体化治疗提供依据。方法:1、AML患者临床病历的收集回顾性分析本院2015年3月-2020年1月收治的243例(M3除外)初发AML患者的临床资料,记录其临床特征、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学特征,分析患者生存情况及影响其预后的主要因素。2、截短体Δ107p53三维蛋白结构分析利用I-TASSER在线工具对p53蛋白全长及Δ107p53蛋白的三维结构进行预测,使用Pymol软件(v1.3.1)对所预测的蛋白质进行突变构建及结构比对分析。3、慢病毒表达体系的构建和稳定克隆的筛选从Gene Bank检索TP53基因(Gen Bank:NM_000546)的cDNA全长序列,跟据Δ107p53的缺失位点和R175H-p53的突变位点得出其CDS区的全长序列,将该序列插入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP表达质粒中,构建pCDH1-Δ107p53,pCDH1-R175H-p53,pCDH1-WT-p53和pCDH1-空载表达载体,采用一代测序的方法鉴定目的质粒是否构建成功。选用TP53基因缺失的人类早幼粒细胞白血病细胞系HL60作为本次实验的模式细胞。通过脂质体法共转染人胚肾细胞系293T细胞,48h和96h分别收集病毒液,并感染HL60细胞。构建细胞模型分别如下:Δ107p53为实验组,R175H-p53为阳性对照组,WT-p53为阴性对照组,pCDH1-空载为空载体对照组。通过流式分选仪分选GFP阳性细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达克隆株,并通过一代测序及Western blot鉴定细胞模型中目的基因的表达。4、CCK-8法和软琼脂糖克隆形成试验检测Δ107p53对HL60细胞增殖的影响利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各组细胞的增殖能力。每组细胞设置3个复孔,分别检测0h,24h,48h,72h和96h各组细胞的吸光度值,用此来反映各组细胞的增殖情况。用软琼脂糖克隆形成试验来验证结果,每组细胞设置3个复孔,每孔接种2000个细胞,2周后扫描拍照,使用Image J软件对其集落大小和数目进行分析。5、流式细胞术检测Δ107p53对HL60细胞周期的影响收集上述四组稳定克隆细胞,预冷PBS洗涤2次后混悬计数。采用碘化丙啶(PI)对处于对数增长期的各组细胞的DNA进行染色,利用流式细胞仪检测其荧光强度来反映DNA的含量,用Mod Fit LT软件对其结果进行分析,以此来计算处于G0/G1期,S期和G2/M期的细胞比例。6、RT-qPCR和Western blot检测p21和bax的表达使用Trizol法提取各组细胞内的总RNA,利用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测p53下游基因P21和BAX的表达。利用Western blot检测p53,p21和bax的表达,使用BCA法对蛋白进行定量,使用Alpha View SA软件对蛋白条带进行分析。结果:1、p53截短体与AML患者预后不良明显相关243例AML患者中,有213例无TP53的突变,17例点突变和13例截短突变。与野生组相比,截短突变组和点突变组患者完全缓解率(CR)更低(P<0.001),无病生存期(DFS)和总生存期(OS)更短(P<0.001)。这一结果提示TP53截短突变与点突变对AML患者的预后影响类似,均表现为DFS和OS变短,预后变差。2、截短体Δ107p53蛋白三维结构明显改变利用I-TASSER工具对p53蛋白全长及Δ107p53蛋白的三维结构进行预测,使用Pymol软件(v1.3.1)对其结构进行分析比对,结果显示Δ107p53的蛋白结构发生明显改变,该截短突变导致p53的部分DNA结合区(DBD),全部核定位信号结构域(NLS)和部分四聚化结构域缺失,构象突变最终可能会影响p53的正常生物学功能。3、慢病毒表达体系的构建和稳定克隆的筛选通过一代测序的结果显示,TP53各序列均已正确插入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP载体中,并且转化结果显示均有GFP的强表达,提示各慢病毒表达载体:pCDH1-Δ107p53,pCDH1-R175H-p53和pCDH1-WT-p53构建成功。用慢病毒感染HL60细胞并利用有限稀释法筛选稳定表达细胞克隆,流式检测其阳性率达95%以上。Western blot的结果显示有目的基因的表达,提示各表达载体均已成功转入HL60细胞系中,各细胞模型构建成功。4、截短体Δ107p53对HL60细胞有明显的促增殖作用CCK-8结果显示,Δ107p53组在48h后开始明显增殖,与WT-p53组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。克隆形成试验结果表明,Δ107p53克隆数量与克隆体积均高于WT-p53组,以上结果提示:截短体Δ107p53具有和R175H-p53同样的促细胞增殖效应。5、截短体Δ107p53促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡流式细胞仪检测G0/G1期,S期和G2/M期各期细胞的比例,其结果显示,与WT-p53组相比,Δ107p53和R175H-p53的G0/G1期细胞比例均降低,S期细胞比例均升高,差异有统计学意义(P<0.001)。这一结果提示Δ107p53和R175H-p53都促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡。6、截短体Δ107p53抑制了p21和bax的表达RT-qPCR的结果显示,Δ107p53组与WT-p53组相比,P21和BAX的表达明显减低(P<0.001),Western blot结果与此结果一致,该结果提示,Δ107p53可抑制p21和bax的表达。结论:1.从临床数据分析得出,具有p53截短体的AML患者表现为DFS和OS变短,预后变差。2.细胞水平实验证明,新型截短体Δ107p53能够促进细胞增殖,其可能是通过抑制bax的表达来实现的,并通过抑制p21的表达来促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡从而发挥其致癌作用。