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目的:观察益气解毒消瘿方对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠(EAT)脾脏单个核细胞(PMBC)Th17、Treg比率,Th17、Treg调控基因RORγt、Foxp3表达,甲状腺自身抗体(TGAb、TPOAb)水平、细胞因子(TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17)水平的调节作用,初步探讨益气解毒消瘿方调节EAT大鼠Th17/Treg免疫失衡的作用机制,为中医药治疗自身免疫性甲状腺炎(AITD)提供可靠的实验依据。
方法:选用SPF级Wistar大鼠60只,取10只作为正常组,其余50只(采用猪甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合,多点皮下注射的方法)造模成EAT。造模成功的48只大鼠随机分为模型组、亚硒酸钠对照组、益气解毒消瘿方低剂量治疗组、益气解毒消瘿方高剂量治疗组,每组12只。分别给予双蒸水、亚硒酸钠、益气解毒消瘿方合剂灌胃8周。实验结束采用流式细胞技术检测大鼠脾脏调节性T细胞(Treg)和辅助T细胞17(Th17)比率。HE染色法观察EAT大鼠甲状腺细胞形态学变化,免疫组化观察甲状腺RORγt、Foxp3蛋白表达,酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠脾脏IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β细胞因子水平,实时定量RT-PCR法检测大鼠甲状腺组织中RORγt、Foxp3、stat3、stat5mRNA的表达。统计方法:数据均采用SPSS22.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,计数资料采用卡方分析。P<0.05有统计学意义。
结果:1.EAT大鼠模型组血清甲状腺抗体水平明显高于正常组大鼠。治疗8周后,高、低剂量中药组、西药组大鼠血清甲状腺抗体水平均有所下降。高、低剂量中药组优于西药组,高、低剂量中药组具有剂量效应关系。
2.在正常组的EAT大鼠中,甲状腺滤泡形态完整,滤泡内充满胶质,滤泡上皮呈立方状。未见炎性细胞浸润。模型组甲状腺滤泡被广泛破坏,结构不完整。甲状腺内可见大量淋巴细胞浸润。西药组甲状腺较模型组好转,部分滤泡结构恢复,淋巴细胞浸润减少。高、低剂中药量组大部分滤泡结构恢复,淋巴细胞浸润减少,高剂量组优于低剂量组。
3.EAT大鼠脾脏PMBC中Treg明显降低,Th17明显升高,Th17/Treg比值升高。亚硒酸钠西药组和中药高低剂量组能显著升高Treg,降低Th17比率,降低Th17/Treg比值。中药组优于西药组,具有量效关系。
4.EAT大鼠模型组甲状腺与正常组比较Foxp3表达减低,RORγt表达增高。治疗后,西药组和中药高低剂量组Foxp3表达升高,RORγt表达降低。中药组优于西药组,具有量效关系。
5.EAT大鼠模型组血清与正常组比较IL-17、IL-6、TGF-β水平升高,IL-10水平降低。治疗后,西药组和中药高低剂量组IL-17、IL-6水平降低,IL-10、TGF-β水平升高。中药高剂量组优于西药组、中药低剂量组。
6.模型组大鼠脾脏组织stat5、foxp3mRNA与对照组相比明显下调;与模型组相比,中药高剂量组与中药低剂量组stat5、foxp3mRNA均明显上调,西药组stat5、foxp3mRNA表达上调不明显,无统计学差异;中药组与西药组相比差异有统计学意义。模型组大鼠脾脏组织rorγt、stat3mRNA与对照组相比明显上调,与模型组相比,中药高剂量组、中药低剂量组rorγt、stat3mRNA表达均明显下调;中药组与西药组相比,差异有统计学意义。
结论:益气解毒消瘿方能降低EAT大鼠甲状腺自身抗体(TGAb、TPOAb)水平,改善EAT大鼠的甲状腺病理改变,调节EAT大鼠的Th17/Treg免疫失衡。其机制是通过调控EAT大鼠甲状腺基因RORγt、Foxp3的表达、调节细胞因子(TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17)的水平来实现的。
方法:选用SPF级Wistar大鼠60只,取10只作为正常组,其余50只(采用猪甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合,多点皮下注射的方法)造模成EAT。造模成功的48只大鼠随机分为模型组、亚硒酸钠对照组、益气解毒消瘿方低剂量治疗组、益气解毒消瘿方高剂量治疗组,每组12只。分别给予双蒸水、亚硒酸钠、益气解毒消瘿方合剂灌胃8周。实验结束采用流式细胞技术检测大鼠脾脏调节性T细胞(Treg)和辅助T细胞17(Th17)比率。HE染色法观察EAT大鼠甲状腺细胞形态学变化,免疫组化观察甲状腺RORγt、Foxp3蛋白表达,酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠脾脏IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β细胞因子水平,实时定量RT-PCR法检测大鼠甲状腺组织中RORγt、Foxp3、stat3、stat5mRNA的表达。统计方法:数据均采用SPSS22.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,计数资料采用卡方分析。P<0.05有统计学意义。
结果:1.EAT大鼠模型组血清甲状腺抗体水平明显高于正常组大鼠。治疗8周后,高、低剂量中药组、西药组大鼠血清甲状腺抗体水平均有所下降。高、低剂量中药组优于西药组,高、低剂量中药组具有剂量效应关系。
2.在正常组的EAT大鼠中,甲状腺滤泡形态完整,滤泡内充满胶质,滤泡上皮呈立方状。未见炎性细胞浸润。模型组甲状腺滤泡被广泛破坏,结构不完整。甲状腺内可见大量淋巴细胞浸润。西药组甲状腺较模型组好转,部分滤泡结构恢复,淋巴细胞浸润减少。高、低剂中药量组大部分滤泡结构恢复,淋巴细胞浸润减少,高剂量组优于低剂量组。
3.EAT大鼠脾脏PMBC中Treg明显降低,Th17明显升高,Th17/Treg比值升高。亚硒酸钠西药组和中药高低剂量组能显著升高Treg,降低Th17比率,降低Th17/Treg比值。中药组优于西药组,具有量效关系。
4.EAT大鼠模型组甲状腺与正常组比较Foxp3表达减低,RORγt表达增高。治疗后,西药组和中药高低剂量组Foxp3表达升高,RORγt表达降低。中药组优于西药组,具有量效关系。
5.EAT大鼠模型组血清与正常组比较IL-17、IL-6、TGF-β水平升高,IL-10水平降低。治疗后,西药组和中药高低剂量组IL-17、IL-6水平降低,IL-10、TGF-β水平升高。中药高剂量组优于西药组、中药低剂量组。
6.模型组大鼠脾脏组织stat5、foxp3mRNA与对照组相比明显下调;与模型组相比,中药高剂量组与中药低剂量组stat5、foxp3mRNA均明显上调,西药组stat5、foxp3mRNA表达上调不明显,无统计学差异;中药组与西药组相比差异有统计学意义。模型组大鼠脾脏组织rorγt、stat3mRNA与对照组相比明显上调,与模型组相比,中药高剂量组、中药低剂量组rorγt、stat3mRNA表达均明显下调;中药组与西药组相比,差异有统计学意义。
结论:益气解毒消瘿方能降低EAT大鼠甲状腺自身抗体(TGAb、TPOAb)水平,改善EAT大鼠的甲状腺病理改变,调节EAT大鼠的Th17/Treg免疫失衡。其机制是通过调控EAT大鼠甲状腺基因RORγt、Foxp3的表达、调节细胞因子(TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17)的水平来实现的。