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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)产生的一种高度传染性猪疫病。临床症状主要为繁殖母猪受精率降低,怀孕母猪流产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及不同年龄段猪呼吸道症状等。PRRS在全球范围内广泛传播,目前已成为威胁全球养猪业最重要的传染病之一,给养猪业带来巨大的经济损失。PRRSV病毒粒子是有囊膜的、其核酸组成为单股的正链RNA。该病毒具有高变异、免疫抑制和持续性感染等特性,导致该病难以防控。因此PRRSV一直是兽医领域重点研究的对象。目前研究发现,PRRSV通过必需受体CD163介导感染宿主细胞。CD163是清道夫受体家族的一个重要成员,由胞外区、跨膜区和胞内区组成。其胞外区含有九个富含半胱氨酸的结构域(scavenger receptor cysteine-rich,SRCR)和两个富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸基序(proline-serine-threonine,PST)。其中CD163胞外区SRCR5结构域在PRRSV感染宿主细胞过程中发挥关键作用,SRCR6-9结构域也发挥一定作用。然而,CD163 SRCR5和SRCR5-9结构域三维结构及其介导PRRSV感染宿主细胞重要氨基酸位点尚不清楚,阻碍了人们对PRRSV与CD163相互作用及PRRSV感染机制的深入理解,从而影响对PRRS的有效防控。因此本研究以PRRSV的必需受体CD163为研究对象,利用结构生物学方法解析猪源CD163 SRCR5结构域(pCD163 SRCR5)、猪源CD163 SRCR5-9结构域(pCD163 SRCR5-9)及不同种属CD163 SRCR5结构域三维结构并根据这些结构鉴定其在PRRSV感染宿主细胞过程中发挥作用的氨基酸位点,为进一步阐明PRRSV感染宿主细胞机制以及防控PRRS奠定基础,具有十分重大的科学意义与应用价值。本论文主要在以下方面对PRRSV必需受体CD163结构与功能展开研究:一、CD163介导PRRSV感染宿主细胞关键结构域SRCR5结构解析及重要氨基酸位点鉴定本研究利用果蝇胚胎S2细胞和巴斯德毕氏酵母X-33成功表达纯化了pCD163 SRCR5结构域重组蛋白,解析了其高分辨率(2.0埃和1.8埃)晶体结构。该结构具有一个明显的长loop区而且电荷具有特殊分布,不同于清道夫受体超级家族的其他成员。随后,根据结构对CD163分别进行了6个位点的氨基酸单点突变。通过PRRSV感染实验发现,转染CD163第561位精氨酸突变体的PK-15细胞对PRRSV经典毒株BJ-4和高致病性毒株HN07-1的感染能力明显下降(p<0.05)。最后,通过PRRSV的结合和侵入实验发现转染CD163第561位精氨酸突变体的PK15细胞对PRRSV结合量和侵入量明显降低(p<0.05),证实了猪源CD163第561位精氨酸在PRRSV感染过程中起着重要作用并且在CD163结合PRRSV的过程中发挥着重要作用。本研究在国内外首先解析了CD163 SRCR结构,同时鉴定了其中介导PRRSV感染宿主细胞的重要氨基酸位点,加深了人们对PRRSV感染机制的认识,并为该病毒的预防和控制提供了分子基础。二、不同种属CD163 SRCR5结构域蛋白结构解析最新研究表明,CD163基因缺失编辑猪不感染1型和2型PRRSV,这证实了CD163是PRRSV必需受体。有趣的是,尽管CD163 SRCR5结构域被证明在PRRSV感染宿主细胞过程中发挥着关键性作用,但是用人CD163样(CD163L1)SRCR8结构域替代SRCR5结构域的基因编辑猪虽然不感染1型PRRSV但仍然感染2型PRRSV。因此,推测CD163 SRCR5结构域在PRRSV宿主细胞嗜性方面可能起着一定的作用,但其机制尚不完全清楚。本研究中利用真核表达系统表达纯化了猿猴CD163 SRCR5结构域(M5)、人CD163 SRCR5结构域(H5)和人CD163L1 SRCR8结构域(H8)。随后,对其晶体结构进行解析。通过对结构进行比较分析,鉴定其中介导PRRSV感染的重要氨基酸位点。所有这些结果将为PRRSV宿主细胞嗜性提供线索。三、CD163介导PRRSV感染宿主细胞功能结构域结构解析虽然pCD163 SRCR5结构域蛋白在PRRSV感染过程中起着关键性作用,但研究表明在PRRSV非易感细胞中仅表达pCD163 SRCR5结构域蛋白,该细胞并不感染PRRSV;而在该细胞中表达pCD163 SRCR5-9结构域蛋白,则该细胞能感染PRRSV。另外,分别表达pCD163 SRCR5和pCD163SRCR5-9结构域重组蛋白,发现pCD163 SRCR5结构域蛋白不能与病毒结合,而pCD163 SRCR5-9结构域蛋白可以和PRRSV结合,这说明在PRRSV感染过程中,pCD163 SRCR5-9结构域发挥着一定的功能。本研究利用果蝇胚胎S2细胞成功表达了pCD163 SRCR5-9结构域重组蛋白。通过多步骤纯化获得纯度较高的蛋白。随后进行结晶及条件优化,最后长出了有衍射能力的晶体,其分辨率约为3.0埃。目前正在对其结构进行解析并鉴定其中介导PRRSV感染的重要氨基酸位点。四、单克隆抗体筛选由于PRRSV具有ADE效应(antibody-dependent enhancement)、抗原高度变异性等特性,目前缺乏行之有效的PRRS防控手段,从PRRSV受体出发进行防控研究也许是一条新的思路。研究已证实pCD163是PRRSV感染宿主细胞的必需受体,其第五个SRCR结构域为介导PRRSV感染的关键结构域。因此本研究设想,制备pCD163 SRCR5结构域重组蛋白单克隆抗体,筛选出能抑制PRRSV感染的特异性抗体。通过解析其晶体结构及其与受体复合物的结构找出相应结合位点,设计小分子或多肽抑制剂用于封闭CD163与PRRSV结合的位点,从而抑制PRRSV的感染。另外,目前国内外缺乏高效的pCD163商品化单克隆抗体,这给pCD163相关功能研究带来诸多不便。本研究制备的pCD163 SRCR5结构域重组蛋白特异性单克隆抗体可为pCD163功能研究提供有利工具。