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全球有大量土地受到盐害的严重影响,为此,培育抗盐植物新品种对保证粮食生产及改善生态环境至关重要。由于缺乏对植物抗盐分子机制的了解和可利用的能提高植物抗盐性的相关基因,抗盐植物新品种的培育受到了很大的限制。
高盐能够破坏植物体内水势平衡和离子平衡,引起渗透胁迫和离子毒害,从而导致细胞损伤,生长受到抑制甚至死亡。为了抵御不良环境,植物感受到离子胁迫后,表达许多基因以保持细胞正常的生命活动和生长发育。
前人的研究表明,盐胁迫诱导产生的细胞质中的Ca2+信号能够激活一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SOS2。激活形式的SOS2能够调控质膜上Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)的活性和液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)的活性,这些离子转运蛋白能够将Na+从细胞质中排出细胞外或将Na+区隔化至液泡中,从而降低细胞内Na+对细胞的毒害。这对植物在盐胁迫下维持正常生长有重要作用。
本研究以抗逆木本植物柠条为材料,参照已公布的NHX的cds序列,根据序列保守区域设计引物,通过RT-PCR的方法获得了CkNHX的cds片段,在此基础上通过3和5RACE技术获得CkNHXcDNA全长。在CkNHXcDNA全长序列分析的基础上,通过多次PCR获得了CkNHX基因组DNA全长。柠条CkNHXcDNA全长为2.0Kb,含有1.6Kb的开放阅读框,其5UTR为145bp,3UTR为262bp,编码一个pI为7.7,MW为59.3KD的由538个氨基酸组成的CkNHX蛋白。CkNHX基因组DNA全长为5kb,含有13个内含子,14个外显子。
将克隆的CkNHXcDNA构建在原核表达载体pET-28a和pGEX4T-3上,在大肠杆菌Ecoli.中进行CkNHX的原核表达。由于CkNHX编码的是一个膜蛋白,很难表达。我们尝试改变多种诱导条件,均未能表达出CkNHX蛋白。
构建了酵母表达载体pYES2-CkNHX和pYES2-CkNHXn(N-end),在酵母Na+敏感型突变体ANT3和AXT3中对柠条Na+/H+逆向转运蛋白(CkNHX)进行功能互补实验。研究发现CkNHX和CkNHXn可以明显的提高酵母Na+敏感型突变体对阳离子Na+和Li+的耐受性。且CkNHX蛋白亲水性C端氨基酸序列缺失时,该蛋白的Na+/H+活性得到增强。以上结果说明CkNHX基因与抗盐性相关。
构建了植物表达载体pNHX并转入农杆菌LBA4404,采用叶盘浸染法转化了烟草和毛白杨。经共培养、抗生素筛选,生根,获得了转化植株。针对所获得的转化植株,利用PCR、RT-PCR和点杂交技术进行了鉴定。结果表明,外源的CkNHX基因已经整合入烟草基因组中,并且得到了表达。
对点杂交阳性的烟草转化植株进行了初步抗盐生理检测,结果表明转入外源的CkNHX基因的烟草其抗盐性比野生型烟草(W38)明显增强,可耐受300mMNaCl。
本项研究提供了具有耐盐作用的CkNHX基因,可用于培育抗盐植物新品系,也对我们了解柠条的抗盐分子机制打下了基础。