[目的]山药Dioseoreas pp.为薯蓣属(Dioscorea L.)周生翅组(Enantiophyllum Uline)植物,是世界上重要的粮食作物,也因其重要的药用价值被世界各国药典收载。我国是山药主要驯化中心之一,迄今主要有薯蓣(怀山药)Dioscorea opposita、参薯(淮山)Dioscorea alata、褐苞薯蓣(广西淮山)Dioscorea persimilis、山薯(广东淮山)Dioscorea fordii4种山药种质资源大面积栽培应用。我国山药栽培变异大,品种资源极为混乱,缺乏统一的品种分类标准；药材也因来源的不同呈现出鉴别难、质量各异的现象。阐述多基原山药的亲缘关系和药材质量状况,从源头控制山药品种混乱和保障药材合理使用具有重要的意义。本研究主要目的是：通过全面收集我国山药品种类型及多基原药材,重点开展山药种质资源多样性、亲缘关系及质量评价等方面的研究,以为复杂山药资源品种分类及亲缘关系提供可靠的分子学证据,并明确多基原山药药材质量现状,为山药安全有效使用提供科学依据。[方法与内容]1DNA分子标记的山药种质资源遗传多样性研究采用ISSR-PCR, SRAP-PCR DNA分子标记及两者技术联用检测我国8个山药居群中的21个山药品种(收集了61样本)的遗传多样性。POPGENE (1.32)软件计算观测等位基因数(Na)、多态位点百分率(PPB)、Shannon表型多样性指数(Ⅰ)、Nei’s基因多样性指数(h)、Nei’s遗传距离(GD)、居群总体遗传多样性(Ht)、基因流(Nm)等参数；Mega4.1软件进行非加权算术平均法聚类和主成分分析；阐述我国山药种质资源多样性、品种归属、种间关系、各居群的遗传分化特征。2DNA基因组测序的山药种质资源亲缘关系研究采用DNA测序技术,对具有代表性的14种山药品种的叶绿体基因组rbcL序列及核糖体ITS序列进行测序。Clusta1x(1.83)软件进行序列比对,统计各序列核苷酸组成比例,获取两两序列间碱基取代数目及遗传距离；根据邻接法(NJ)和最大简约法(MP)Mega4.1软件构建分子系统发育树,系统阐述我国山药种质资源进化特征及亲缘关系。3山药的鉴别研究采用性状观察、块茎横切面与叶片组织显微成像、薄层、红外指纹图谱等技术对4种基原山药进行鉴别研究,阐述多基原山药的主要鉴别要点。4山药重金属、二氧化硫检查及安全性评价照2010版《中国药典》附录ⅨB方法对来自4个基原的22批山药中的铅、镉、砷、汞、铜等重金属含量进行检测,并按2010版《中国药典》附录ⅨU法测定二氧化硫含量。以《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》(WM/T2-2004)和相关食品标准(NY861-2004)为参照,采用单因子污染指数法和Nemerow综合污染指数法,评价我国山药的药用和食用安全性。5山药糖类成分比较研究以提取温度、乙醇浓度、固液比、提取时间为考察指标,采用正交设计法筛选山药低聚糖提取工艺；并以水固比、提取时间、温度为考察指标,响应面优化山药多糖的提取方案。按上述最佳工艺进行提取,采用UV测定山药低聚糖和多糖含量,比较多基原山药糖类成分的差异性。6山药尿囊素的含量测定研究采用高效液相色谱法(HPLC-DAD)测定山药中尿囊素含量,建立有效灵敏的尿囊素测定方法,比较多基原山药尿囊素含量的差异性。7山药皂苷类成分的比较研究采用紫外分光光度法测定山药总皂苷含量,高效液相色谱法(HPLC-DAD)测定薯蓣皂苷含量,比较多基原山药皂苷类成分的差异性；并采用高效薄层指纹图谱(HPTLC)技术评价多基原药材和饮片的特征差异性及共有模式。[结果]1DNA分子标记的山药种质资源遗传多样性研究1.1山药种质资源遗传多样性的ISSR研究11条ISSR引物中扩增出150条清晰条带,其中多态性条带143条,平均多态位位点性百分率达95.3%。山药总居群中,Nei基因多样性指数(H)为0.2980、Shannon信息指数为(Ⅰ)0.4560、居群间基因多样性(Ht)为0.3168,表明我国山药在居群间呈现很高的多样性。山药居群内多样性存在较大的差异,多态位点百分率在0～51.33%,以河南温县薯蓣栽培群体内最高,福建三明的山薯栽培群体内最低。居群基因分化系数Gst为0.7796、基因流(Nm)为0.1414,提示山药居群间遗传变异大于居群内遗传变异。8个居群间的遗传距离在0.0712～0.5032,根据栽培物种的不同被聚为4类；21个山药品种的遗传距离则在0.0154～0.7225之间,UPGUMA聚类可将21个品种逐一鉴定并归属到4个山药物种内。1.2山药种质资源的遗传多样性的SRAP研究60对SRAP引物共检测到309条清晰条带,其中多态性条带289条,平均多态性位点百分率达到了93.53%。在总居群上,Nei基因多样性指数(H)为0.2881、Shannon信息指数为(Ⅰ)0.4416、居群间基因多样性(Ht)为0.2891,同样阐述了我国山药居群间具有很高的多样性。居群内以河南温县薯蓣栽培群体多样性最高,多态位点百分率为40.96%,而福建三明(FJSM)和浙江高楼(ZJRG)山薯栽培群体多样性最低(PPb=0%)。居群基因分化系数Gst为0.8658、基因流(Nm)为0.0775,进一步揭示了山药居群间遗传变异大于居群内遗传变异。8个居群间的遗传距离在0.0498-0.4879,因栽培物种的不同被分为4类；SRAP标记同样能将对21个山药品种进行鉴定,根据来源的不同分别归属到薯蓣、参薯、褐苞薯蓣、山薯种内。1.3山药种质资源的遗传多样性的ISSR和SRAP综合分析Mantel检测表明两种标记分析结果具有显著的相关性(r=0.9523)；综合ISSR和SRAP检测的数据,山药种质资源的总体的多态位性达到了94.12%,Nei基因多样性指数为0.2912,Shannon信息指数为0.4462,群体基因分化系数Gst为0.8336。薯蓣、参薯、山薯、褐苞薯蓣种间遗传差异,占据了山药总体多样性的83.36%,而种内多样性仅占总体多样性的16.64%。不同山药种内的遗传多样性呈现为薯蓣(62.31%)>参薯(31.15%)>褐苞薯蓣(12.20%)>山薯(5.88%)的趋势。4个物种种间遗传距离在0.2749-0.4255之间,其中以薯蓣与参薯的遗传距离最小、山薯与褐苞薯蓣遗传距离最大。2DNA基因组测序的山药种质资源亲缘关系研究2.1叶绿体基因组rbcL序列的比较研究获得14种山药品种的rbcL序列,其长度为1115bp-1168bp,序列的G+C含量为43.9%-44.5%；当空位始终作缺失处理时,存在变异位点19个,其中简约信息位点6个,单核酸多态位点13个,转换与颠换比率为2.066。14种山药品种K2-P遗传距离介于0～0.0118之间,两两之间存在0-14个核苷酸差异。基于rbcL序列构建的系统发育树的拓扑结构十分稳定,其一致性指数(CI)及存留指数(RI)分别达到了0.9983、0.9231,表明山药rbcL序列具有高度的保守性。系统发育树揭示参薯与山薯,薯蓣和褐苞薯蓣亲缘关系密切,薯蓣与山薯亲缘关系疏远。2.2核糖体基因组ITS序列的比较研究通过克隆获得14种山药品种的ITS目的条带,测序表明序列长度为558bp～594bp,序列的G+C含量为45.6%-52.6%；序列空位作缺失处理并经比对发现,ITS1区具有137个变异位点,其中117个简约信息位点,ITS2区则有122个变异位点,其中简约信息位点98个；转换与颠换比率为5.347。14种山药品种K2-P遗传距离在0-0.5172,两两之间存在0-184个核苷酸差异。基于ITS序列构建的系统发育树同样阐明：参薯与山薯遗传关系亲密,进一步发现薯蓣种内乐南山药品种与褐苞薯蓣亲缘关系也十分密切。3山药的鉴别研究3.1山药性状与显微鉴定在性状上怀山药和广西淮山表面较为光滑,淮山和广东淮山则表面粗糙。块茎横切面显微特征上差异性表现为：怀山药中柱鞘部位无石细胞层环；淮山中柱鞘部位具连续或不连续石细胞层环,且粘液细胞多分布于皮层；广西淮山具连续且较薄石细胞环层；广东淮山具连续且较厚石细胞环层。叶片显微特征相似。3.2山药薄层鉴别怀山药与对照药材薄层行为基本一致,但斑点颜色少许差异；淮山、广西淮山、广东淮山与对照药材存在少量差异；在Rf值0.85处,广西淮山、广东淮山无任何斑点,淮山斑点则较弱,而怀山药及对照药材斑点清晰明亮；Rf值0.4处,广东淮山和广西淮山薄层行为存在显著差异,可鉴别两者。3.3山药红外指纹鉴别4种基原山药与对照药材整体红外指纹图谱相近。二阶导数处理后峰形和峰位置存在较大差异,具体表现：2348cm-1处,4种基原山药均具有强吸收峰,而对照药材则无；1739cm-1处,广西淮山和广东淮山具有较强吸收峰,且前者强于后者,而怀山药、淮山及对照药材在该位置均无吸收峰；1707cm-1处,4种山药吸收强度表现关系为广西淮山>广东淮山>淮山>怀山药,而对照药材则无吸收峰；此外,1446cm-1、1427cm-1、1409cm-13个连续吸收峰是广西淮山、广东淮山区别怀山药、淮山的特征吸收点。4山药重金属、二氧化硫检查及安全性评价各批山药中铜含量最高,铅其次,砷含量第三,镉、汞含量较低,除河南产区山药铜含量超标以外,其它指标均在《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》(WM/T2-2004)标准范围内；无硫饮片二氧化硫残留20mg·kg-1左右,硫磺熏制山药均超过400mg·kg-1以上。以中药材标准评价,无硫山药综合污染指数P綜合均小于0.7,有硫山药P综合介于0.76-1.29,安全性属警戒和轻度污染状态；以食品标准评价,大部分山药P综合超过0.7以上,有的甚至达到了5.0以上,则属中度和重度污染水平。5山药糖类成分比较研究5.1山药低聚糖提取工艺与含量测定确定山药低聚糖成分最佳提取工艺为：液固比20：1,乙醇体积分数60%,80℃水浴下浸提2次,每次1h,可较完全提取低聚糖成分。4种基原山药平均低聚糖含量表现关系为：淮山(5.96%)>广东淮山(4.83%)>怀山药(4.29%)>广西淮山(2.90%)。5.2山药多糖提取工艺与含量测定确定山药多糖得最优提取工艺为：水固比40：1、90℃水浴浸提1.5h。4种基原山药平均多聚糖含量表现关系为：淮山(13.18%)>广西淮山(11.09%)>怀山药(9.98%)>广东淮山(8.92%),提示多基原山药均具有较高多糖含量。6.山药尿囊素的含量测定研究确定尿囊素HPLC测定的色谱条件为：色谱柱C1s柱(200mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇：水=10：90,并经磷酸二氢钾(KH22PO3)调节流动相pH4～9；流速0.5mL·min-1;柱温30℃；检测波长：224mn。尿囊素在0.40μg～6.00μg范围内线性关系良好,方程为y=171.078χ+16.712(R=0.9999),平均回收率100.32%(RSD=1.26%)。按该方法测定,4种基原山药中,以淮山尿囊素最高(1.03%),怀山药与广东淮山含量相当(0.90%左右),褐苞薯蓣来源山药含量最低(0.73%)。7山药皂苷类成分的研究7.1山药总皂苷含量测定各批山药均具有较高的总皂苷含量,4种基原山药以河南温县、武涉的地道药材怀山药的含量最高,广西淮山与浙江产的淮山含量相当,广东淮山则最低,平均含量具体表现为怀山药(2.255mg.g-1)>淮山(1.346mg.g-1)>广西淮山(1.275mg.g-1)>广东淮山(0.805mg·g-1)。在不同规格山药中以无硫饮片的总皂苷含量最高。7.2山药薯蓣皂苷HPLC-DAD测定确定薯蓣皂苷HPLC测定色谱条件为：色谱柱C18柱(200mm×4.6mm,5μm);流动相：甲醇：水=88：12；流速：1.0mL.min-1;柱温25℃；检测波长：203nm。薯蓣皂苷在10.4μg.mE-1～156.0μg.mL-1浓度范围内呈良好的线性关系,线性方程为：y=5.139x+16.815(r=0.999),回收率为100.25%(RSD=1.32%)。薯蓣皂苷含量以怀山药(814.76μtg.g-1)>淮山(548.92μg.g-1)>广西淮山(438.13μg.g-1)>广东淮山(343.43μ.g.g-1)。在不同规格山药中以无硫饮片的薯蓣皂苷含量最高。7.3山药皂苷类成分高效薄层色谱指纹图谱研究确定了甲醇超声处理作为提取方法,氯仿-甲醇-水(13：7：2)为展开剂,在相对湿度35%、温度25℃条件下预平衡30min后进行展开,10%的硫酸乙醇喷雾显色,366nm检视荧光薄层色谱,可得到重现性较好、分离效果较好的高效薄层色谱指纹图谱。22份样品共指认了8个特征色谱峰,构成了山药薄层色谱指纹图谱共有模式,其中怀山药与共有模式相似度最高(0.8323)、淮山其次(0.6720)、广西淮山最低(0.5503)。[结论]1山药种质资源遗传多样性研究1.1ISSR、SRAP两种分子标记是有效检测山药种质资源的遗传多样性和品种鉴定的可靠技术。ISSR.SRAP综合分析揭示：我国山药种质资源多样性总体处于很高的水平(PPb=94.12%),但主要由4种山药种间遗传差异性引起,贡献了总体多样性的83.36%(Gst=0.8336)；而种内多样性因4个山药物种表现各异,以薯蓣和参薯呈现一定多样性水平。归纳认为,我国山药因无性繁殖方式、单一性状的定向选育、品种无序交流等影响,种内多样性呈下降趋势,需拓宽山药种内的遗传背景。1.2不同居群的山药遗传距离与和地理分布具有一定相关性,支持环境相同则相聚的原则,南方地区经多年的引种栽培,已形成了薯蓣资源新的独立栽培群体。1.3ISSR和SRAP均可有效地将我国常用山药品种归属到4种基原物种内,UPGMA聚类进一步支持将我国山药分为薯蓣、参薯、山薯及褐苞薯蓣4大类,符合经典分类方法,山药品种的准确定位归属,为我国众多山药品种的准确鉴定提供了科学依据。2DNA基因组测序的山药种质资源亲缘关系研究2.1根据rbcL、ITS序列构建的系统发育树表明：我国山药种质资源是一个单系群,是由薯蓣属二倍体根茎组植物沿不同方向演化而来；参薯与山薯关系亲密,在系统位置上相对孤立；参薯要先于褐苞薯蓣进化,并不支持参薯是亲缘野生种D.hamiltonii和褐苞薯蓣杂交而来的说法；薯蓣、褐苞薯蓣、日本薯蓣关系亲密,进化关系上日本薯蓣先于薯蓣进化,支持薯蓣是由日本薯演化而来的观点；基于rbcL、ITS序列的系统发育树基本澄清了山药类植物的来源及亲缘关系。2.2此外,基于山药种质资源rbcL、ITS序列的碱基的差异性,也是准确鉴别各山药品种的可靠的依据；环境与碱基差异相关性为研究地道药材的形成提供了科学方法。3山药的鉴别研究3.1根据山药块茎横切面及叶片组织形态的显微特征,可有效鉴别多基原山药。3.2建立的山药薄层色谱鉴别方法,方法简单,专属性强,能客观反映我国不同基原山药的差异性,是对药典方法的有益补充。3.3处理后的FTIR红外指纹图谱的差异特征,可快速地鉴别不同来源的山药。4山药重金属、二氧化硫检查及安全性评价我国大部分山药药材处于警戒和轻度污染状态,主要由二氧化硫残留较高致使,多数山药相对于食用标准处于中度和重度污染,山药存在较大的安全隐患。现行中药材准仍能较为宽松,难于保障山药药用安全。5山药糖类成分比较研究5.1山药低聚糖提取工艺稳定、重复性好,为山药中低聚糖成分开发利用提供了科学依据；多基原山药低聚糖含量均较高,且低聚糖多具活性,可作为评价山药质量的指标之一。5.2Design-Expert优化的提取工艺、稳定可信、重复性好,可作为山药多糖的提取方法；多糖是山药的有效成分之一,不同来源山药多糖存在明显的差异,多糖含量可作为山药药材和饮片质量评价的重要依据。6山药尿囊素的含量测定研究本实验建立的尿囊素HPLC-DAD检测方法准确性高,稳定性、重复性佳。尿囊素是山药重要有效成分,研究发现淮山、广东淮山、广西淮山同样具有较高尿囊素含量,作为山药的新资源使用有一定的依据。不同规格山药以无硫饮片中尿囊素最高,硫磺熏制不利于山药尿囊素的累积。7山药皂苷类成分的研究7.1山药总皂苷UV测定方法的精确性、重复性、稳定性较好,可作为山药总皂苷含量的评测依据。不同基原山药总皂苷存在明显差异,在选择山药药用时应区别对待。硫磺熏制已大大降低了山药中的总皂苷的累积。7.2薯蓣皂苷HPLC测定方法专一稳定,能有效地检测到山药中含量极微薯蓣皂苷,可用于山药药材和饮片质量评价。7.3本研究得到了重现性较好、分离效果较好的高效薄层色谱指纹图谱,为多基原山药的鉴别和质量评价提供了直观的依据。高效薄层指纹图谱构成了我国山药薄层色谱指纹图谱共有模式,能从整体上反映出多基原山药差异性,符合中药质量评价的整体观。四种基原山药指纹整体差异存在一定差异性,参薯、山薯、褐苞薯蓣作为山药新资源使用还需慎重对待。以薄层扫描法进行薯蓣皂苷定量分析,可有效评价各批山药的质量。8本研究的主要创新点8.1采用DNA分子标记技术全面评价了我国山药种质资源的遗传多样性现状,基于DNA标记多态性的品种归属,为山药品种鉴定和分类提供了科学依据；首次获得我国常见14种山药品种的rbcL、ITS序列,序列构建的系统发育树明确了山药种质资源亲缘关系。8.2系统研究了我国常见4种基原山药的鉴别特征、安全性以及多指标的质量差异性,首次获得山药高效薄层色谱指纹图谱,直观展现了多基原山药质量差异性,为山药合理使用提供了科学依据。