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谷胱甘肽是一种含有巯基的小分子肽类物质,具有抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力等多种生理功能,在医药、化妆品和食品行业有着广泛的应用。本文以提高体外多酶催化合成谷胱甘肽效率为目标,将锚定区域(Dockerin domain)引入谷胱甘肽双功能酶GshF,实现ATP再生的ADK酶和PAP酶,在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化后与蛋白支架进行组装,用于催化合成谷胱甘肽。克隆获得锚定区域基因和谷胱甘肽双功能酶GshF、ADK和PAP基因,通过酶切连接后整合到pET-28a(+)载体,构建重组表达载体pET28a(+)-GshF-Doc1-1,pET28a(+)-PAP-Doc1-3,pET28a(+)-ADK-DocⅡ。另外,从嗜纤维梭菌基因组DNA PCR扩增获得将含有对应粘连区域(cohesin)的Coh1-1、CohⅡ和CBD-Coh1-3基因,连接到pET-Duet1载体,构建重组表达载体pETDuet-1-Coh1-1-CohⅡ-CBD-Coh1-3。以E. coli BL21(DE3)作为表达宿主,优化重组蛋白GshF-Doc1-1的表达条件。结果表明：培养宿主菌至其对数生长中期,培养温度设置为28℃,加入最终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导,GshF-Doc1-1的最高酶活力可达2332 U/L。对重组表达蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后GshF-Doc1-1的比酶活达13.24U/mg,是粗酶的13.4倍,酶活收率达到76%。开展了GshF-Doc1-1酶学特性研究,GshF-Doc1-1催化反应的最适温度为37℃,最适pH为8.5,催化反应最适的ATP和Mg2+浓度分别为10 mmol/L和30 mmol/L,过量的ATP对酶催化反应有一定的抑制作用。重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-ADK-DocⅡ经IPTG诱导表达的产物,利用Ni柱亲和层析纯化,纯化后的ADK-DocⅡ比酶活达2.8U/mg。利用ADK-DocⅡ催化ADP生成ATP,反应平衡后ATP:ADP=1:1.32, ADP的转化率达到42.4%,反应最佳pH为8.0,最适温度为40℃。重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-PAP-Doc1-3经IPTG诱导表达的产物,利用Ni柱亲和层析纯化,纯化后的PAP-Doc1-3比酶活达2.3U/mg。利用PAP-Doc1-3催化AMP生成ADP,反应平衡后AMP:ADP=1:1.52,ADP的转化率达到70.2%。反应最佳pH为8.5,最适温度为50℃。最后,将GshF-Docl-1、ADK-DocⅡ、PAP-Docl-3固定在蛋白支架上,用于催化合成谷胱甘肽,在加入终浓度为5 mmol/L ATP和5 mmol/L polyP条件下,经过3小时的反应,GSH的最终产量可达5.6mmol/L,比未采用蛋白支架组装多酶合成谷胱甘肽的产量提高了25%左右。此过程中相当于消耗了11.2 mmol/LATP,表明ATP再生效率约为2。多酶催化体系反应的最适反应温度为37℃,最适pH为7.5。