第一部分硫化氢激活PPARδ/eNOS通路改善高血压患者肾动脉内皮依赖的舒张功能目的:硫化氢(H2S)被证实为第三种气体信号分子,其作为气体调质在心血管系统发挥重要作用,具有改善血管内皮功能紊乱的作用,但是其保护内皮作用的机制目前还远未阐明清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体δ(peroxisome proliferators-activated receptorδ,PPARδ)作为核受体家族的一员,在代谢方面发挥的作用已经为大家所熟知。最近的研究发现,PPARδ能够通过激活eNOS/NO通路增强内皮依赖的舒张功能。因此,我们提出假设认为H2S通过激活PPARδ/eNOS通路发挥改善内皮的作用。本研究选取高血压患者和血压正常患者的肾动脉,旨在探讨H2S对PPARδ/eNOS通路的影响,以及是否通过该通路改善高血压患者的内皮舒张功能紊乱。方法:本实验选取罹患高血压或血压正常并行肾切除患者的肾动脉。高血压患者的入选标准为收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg,不合并糖尿病。入选患者均已签署知情同意书。高血压组和血压正常组的年龄无差异(64.00±2.892岁vs 59.92±2.058岁)。高血压组和正常血压组的肾动脉在加入或不加入硫氢化钠(NaHS,50μmol/L)的情况下,置于完全DMEM培养基中37℃孵育12 h。孵育后,取肾动脉在器官浴槽中检测乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)诱导的内皮依赖性血管舒张功能。利用Western blot检测血管紧张素受体1(AngiotensinⅡreceptor 1,AT1)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathioneγlyase,CSE)、PPARδ、磷酸化内皮型一氧化氮和酶(phosphorylated endothelial nitric oxide synthase,p-eNOS)、p-Akt和p-AMPK等相关蛋白的表达。人脐静脉内皮细胞经过AngII处理后,观察H2S以及各种工具药对一氧化氮(nitric oxide,NO)生成量的影响。应用激光共聚焦显微镜,检测NO探针的荧光强度来反映NO含量。结果:1高血压组肾动脉对ach诱导的内皮依赖性的舒张反应性较血压正常组肾动脉明显下降。nahs慢性孵育高血压患者肾动脉可改善内皮依赖性舒张功能。2高血压组患者的肾动脉at1蛋白表达水平显著升高,cse蛋白表达水平下降。nahs慢性孵育可下调高血压患者肾动脉at1受体表达,增加cse蛋白水平。3高血压组患者肾动脉pparδ蛋白表达下调,p-enos表达水平降低。nahs慢性孵育可上调高血压患者肾动脉pparδ受体表达,提高p-enos表达水平。4nahs慢性孵育可增加高血压患者肾动脉p-akt和p-ampk蛋白表达水平。5在培养的人脐静脉内皮细胞中,nahs可增加血管紧张素ii(angiotensinii,angii)处理的人脐静脉内皮细胞no生成量。nahs促进no生成的作用可被gsk0660(1μmol/l,pparδ受体阻断剂)、ly294002(5μmol/l,pi3k抑制剂)、wortmanin(0.1μmol/l,pi3k抑制剂)和compoundc(10μmol/l,ampkα抑制剂)部分阻断。而应用at1受体的阻断剂可发挥与nahs相似的作用。结论:h2s可改善高血压患者内皮依赖性的血管舒张功能,其改善内皮功能的作用可能与改善血管内源性cse和at1的失衡,以及激活pparδ/enos通路有关。pi3k/akt和ampk信号通路可能参与了h2s激活pparδ/enos通路的作用。第二部分硫化氢激活pparδ改善肾血管性高血压大鼠肾动脉内皮依赖的舒张功能目的:大鼠肾血管性高血压模型是基础研究中常用的高血压模型之一。肾血管性高血压时肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,ras)的过度激活,最终导致内皮功能受损。本部分研究利用大鼠肾血管性高血压模型,进一步证实h2s通过激活pparδ通路,改善高血压时动脉内皮以来的舒张功能,并探讨其激活pparδ的信号转导通路。方法:本实验选用健康雄性spraguedawley(sd)大鼠,7周龄,190-200克,随机分为四组:sham组、sham+nahs组、2k1c组和2k1c+nahs组。2k1c和2k1c+nahs组大鼠行两肾一夹手术制备肾血管性高血压模型。sham+nahs和2k1c+nahs组大鼠于两肾一夹手术或假手术后第三周开始腹腔注射nahs(56μmol/kg),其余两组于相同时间点腹腔注射生理盐水。每4周通过鼠尾动脉测量动物血压。第20周末利用小动物超声检测肾动脉血流量;各组动物取肾动脉行微血管张力测定,观察内皮和非内皮依赖性血管舒张功能,并且应用pparδ受体阻断剂gsk0660(1μmol/l)、激动剂gw0742(0.1μmol/l)、ampkα磷酸化抑制剂(compoundc10μmol/l)、pi3k的抑制剂ly294002(5μmol/l)和wortmanin(0.1μmol/l)以及no合酶的抑制剂l-name(100μmol/l),通过慢性孵育2k1c组和2k1c+nahs组大鼠肾动脉观察上述阻断剂对nahs作用的影响。利用高压液相质谱法测定血浆中h2s含量;利用硝酸盐还原酶法测定血浆中no含量;he染色观察肾脏形态学变化;利用westernblot检测pparδ、cse、p-enos、p-akt和p-ampk等蛋白的表达水平。结果:1四组大鼠一般情况监测结果显示:2k1c组和2k1c+nahs组大鼠体重在术后12周开始出现增长缓慢,并一直持续至实验结束。四组动物的进食量和饮水量无差异,2k1c组的尿量较其他三组动物显著升高。2慢性外源性给予nahs可显著降低2k1c大鼠的平均动脉压和血浆中angii水平以及肾动脉at1受体蛋白表达水平。3慢性外源性给予nahs可显著降低2k1c大鼠左右肾脏重量比、改善肾功能、减轻肾实质形态学损伤。4慢性外源性给予nahs可显著增加2k1c大鼠未钳夹侧肾血流量。5慢性外源性给予nahs可显著改善2k1c大鼠内皮依赖性的血管舒张功能,而对非内皮依赖性的舒张功能无显著影响6慢性外源性给予nahs可显著升高血浆h2s和no含量,上调肾动脉cse蛋白表达水平。7慢性外源性给予nahs可显著上调2k1c大鼠肾动脉pparδ和p-enos的蛋白表达水平。8慢性外源性给予nahs可显著上调2k1c大鼠肾动脉p-akt和p-ampk的蛋白表达水平。9应用pparδ受体阻断剂、激动剂,ampkα磷酸化抑制剂,pi3k的抑制剂,no合酶的抑制剂,通过慢性孵育2k1c组和2k1c+nahs组大鼠肾动脉,发现上述阻断剂可部分或全部阻断nahs的作用。结论:h2s可改善高血压患者内皮依赖性的血管舒张功能,其改善内皮功能的作用可能与改善血管内源性cse和at1的失衡,以及激活pparδ/enos通路有关。pi3k/akt和ampk信号通路可能参与了h2s激活pparδ/enos通路,并进而改善高血压动脉内皮依赖性血管舒张功能的作用。第三部分硫化氢通过下调bmp4/cox2的表达改善肾血管性高血压大鼠肾动脉内皮依赖的收缩功能目的:高血压时,内皮功能紊乱一方面表现为内皮依赖的血管舒张功能降低,另一方面表现为内皮依赖的血管收缩功能增强。骨形成蛋白4(bonemorphogenicprotein4,bmp4)属于转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)超家族,主要调节骨骼的胚胎发育和再生修复。最近研究发现,bmp4在心血管系统中发挥重要作用。bmp4通过增加nadph氧化酶的表达和活性,促进活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ros)过度生成,进而增加环氧酶2(cyclooxygenase2,cox2)活性,导致前列腺素类物质生成和释放增多,从而损伤血管内皮,增强血管内皮依赖的收缩功能,最终促进高血压形成。已有研究显示,bmp4/cox2表达增加与自发性高血压大鼠内皮依赖性的血管收缩功能增强有关。本研究利用2k1c制备的高血压大鼠模型,旨在观察h2s改善高血压大鼠内皮依赖的血管收缩功能,并观察h2s对bmp4/cox2表达的影响。方法:健康雄性sd大鼠,7周龄,190-200克,随机分为四组:sham组、sham+nahs组、2k1c组和2k1c+nahs组。2k1c和2k1c+nahs组大鼠行两肾一夹手术制备肾血管性高血压模型。sham+nahs和2k1c+nahs组大鼠于两肾一夹手术或假手术后第三周开始腹腔注射nahs(56μmol/kg),其余两组于相同时间点腹腔注射生理盐水。开始应用nahs后每4周通过鼠尾动脉测量动物血压;第20周末各组动物取肾动脉行微血管张力的测定,观察血管内皮依赖性的收缩功能;利用高压液相质谱法测定血浆中h2s的含量;利用westernblot检测cse、at1、bmp4、cox2以及氧化应激相关蛋白的表达水平;利用试剂盒检测sod活性和mda含量。结果1 2K1C高血压大鼠慢性给予NaHS处理,可显著降低大鼠动脉血压,上调CSE蛋白表达,增加血浆中H2S含量。2 2K1C大鼠肾动脉内皮依赖性收缩功能显著增强。外源性给予NaHS可改善高血压大鼠内皮依赖性血管收缩功能。3外源性给予NaHS可显著下调肾血管性高血压大鼠肾动脉中AT1受体和BMP 4的蛋白表达。4外源性给予NaHS可显著降低肾血管性高血压大鼠体内氧化应激水平,氧化应激相关蛋白NOX2、NOX4、P67、Nitrotysine表达增加。5外源性给予NaHS可显著升高SOD活性,降低MDA含量。6外源性给予NaHS可显著改变p38 MAPK和COX-2的蛋白表达水平。结论:H2S可显著改善高血压大鼠肾动脉血管内皮依赖的收缩功能,其改善内皮功能的作用可能与抑制BMP4/ROS/COX2通路有关。