论文部分内容阅读
外周神经损伤后，初级感觉传入神经纤维产生的自发放电是神经病理性疼痛产生的重要原因。大量的研究表明，神经损伤引起的电压门控钠离子通道的异常表达是异位放电产生的原因。然而神经损伤如何引起电压门控钠离子通道的表达异常目前仍然不清楚。在神经病理性疼痛机制的研究中，细胞因子的作用越来越受到重视。神经损伤后，多种细胞能够合成和释放肿瘤坏死因子(TNF-α)，TNF-α是神经损伤后最早表达和释放的细胞因子，它能够启动其他细胞因子的表达和释放。至今，TNF-α诱发痛觉过敏的作用机制仍无定论，可能是通过某种途径引起神经元异常兴奋，从而导致神经病理性疼痛的产生。为了阐明电压门控性钠离子通道Nav1.6和Nav1.8与神经病理性疼痛的关系，我们研究了运动神经损伤对电压门控性钠离子通道Nav1.6和Nav1.8表达的影响。
第一部分：L5-VRT引起Nav1.6和Nav1.8在大鼠背根神经节神经元表达上调。
本实验以行为学测试为指标结合实时荧光定量PCR，免疫荧光组织化学，免疫荧光细胞化学和免疫荧光双染技术，以及体外背根神经节神经元细胞培养技术，观察大鼠在5-VRT和在坐骨神经周围给予重组大鼠TNF(recombinant rat TNF，rrTNF)处理(peri-sciatic administration of rrTNF，PST)后，大鼠DRG内Nav1.6和Nav1.8的表达情况和细胞定位。我们发现(1)L5-VRT后1d就可引起Nav1.6和Nav1.8在大鼠双侧L4及L5 DRG内mRNA和蛋白质表达上调，7d达到高峰，至术后5周时仍有一定水平表达；(2)L5-VRT1d可以引起Nav1.8-IR(Nav1.8immunoreactivity,Nav1.8-IR)在大鼠双侧近端坐骨神经内显著增强，7d达到高峰，至术后5周时仍有显著性差异；L5-VRT3d可以引起Nav1.8-IR在大鼠双侧远端坐骨神经内显著增强，14d达到高峰，显著性差异可以维持到术后5周。(3)在损伤侧L4和L5 DRG内，Nav1.6的免疫活性在L4、L5 DRG内的伤害性感受C类神经元中增强，而Nav1.8的免疫活性在A类神经元和C类神经元均有增强，但以C类神经元为主；(4)在损伤侧L4、L5 DRG内，大部分TNF-α阳性神经元同时表达Nav1.6和Nav1.8；(5)在坐骨神经周围给予低剂量的rrTNF(PST)，观察到损伤侧L4、L5 DRG内Nav1.6-IR和Nav1.8-IR增强。(6)在体外培养的背根神经节神经元细胞中，分别添加不同剂量的rrTNF处理5小时，和溶剂对照组相比，1pg/ml rrTNF对Nav1.6表达无影响，10pg/ml，100pg/ml和1000pg/ml rrTNF可引起Nav1.6-IR显著性增强(p＜0.001)。1pg/ml和10pg/ml的rrTNF对Nav1.8表达无变化，添加100pg/ml和1000pg/mlrrTNF后，Nav1.8-IR显著性增强(p＜0.001)。上述结果表明，运动神经损伤(L5-VRT)后，Nav1.6和Nav1.8在大鼠双侧L4和L5 DRG内的表达均增强，DRG内Nav1.6和Nav1.8的表达增加与TNF-α增加密切相关。
第二部分：TNF-α在L5-VRT引起背根神经节内Nav1.6和Nav1.8上调中的作用。
本实验以行为学测试为指标结合免疫荧光组织化学技术，观察了TNF-α对DRG神经元内Nav1.6和Nav1.8表达的影响，我们发现(1)术前2h腹腔注射thalidomide，而后每天1次，持续7d，能有效缓解L5-VRT引起的神经病理性疼痛，并显著降低Nav1.6和Nav1.8在DRG内的表达；(2)术后7d给予thalidomide，每天一次，连续7d，不能减轻L5-VRT引起的大鼠痛过敏，对DRG内Nav1.6和Nav1.8的上调仅有部分阻断作用。(3)在TNFR-1(-/-)小鼠，与野生型C57小鼠的L5-VRT7天模型组相比，TNFR-1(-/-)小鼠L5-VRT术后7天，L4，L5 DRG内Nav1.8的表达被显著抑制。以上结果提示TNF-α可能是运动神经损伤后引起DRG内Nav1.6和Nav1.8上调的原因，Nav1.6和Nav1.8的上调可能在神经病理性疼痛形成的早期和维持阶段均发挥重要作用。
结论：
⑴选择性切断L5前根(L5-VRT)，可引起双侧L4、L5 DRG内Nav1.6和Nav1.8 mRNA表达上调。
⑵选择性切断L5前根(L5-VRT)和在坐骨神经周围给予重组大鼠rrTNF处理后(PST)，均可引起Nav1.6-IR和Nav1.8-IR在双侧L4、L5 DRG内增强。L5-VRT1d可以引起Nav1.8-IR在大鼠双侧近端坐骨神经内显著增强，7d达到高峰，至术后5周时仍有显著性差异；L5-VRT3d可以引起Nav1.8-IR在大鼠双侧远端坐骨神经内显著增强，14d达到高峰，至术后5周时仍有显著性差异。Nav1.6-IR主要在伤害性感受C类神经元中增强，Nav1.8-IR可见于DRG内A类和C类神经元，但以伤害性感受C类神经元为主。L5-VRT大鼠DRG内大部分TNF-α阳性神经元同时表达Nav1.6和Nav1.8。在体外培养的DRG神经元中加入rrTNF可以剂量依赖地引起Nav1.6和Nav1.8表达上调。以上结果表明选择性损伤运动神经(L5-VRT)可以引起Nav1.6和Nav1.8表达上调，Nav1.6和Nav1.8的上调与TNF-α密切相关。
⑶抑制TNF-α的合成可缓解大鼠机械性痛过敏和抑制DRG内Nav1.6和Nav1.8的表达上调，提示TNF-α是神经损伤后引起背根神经节中Nav1.6和Nav1.8上调的促发因素。Nav1.6和Nav1.8的上调可能是使初级感觉传入兴奋性升高，引起异位放电产生进而诱发和维持痛过敏的直接原因。
⑷敲除TNFR-1基因可以显著抑制L5-VRT引起的L4和L5 DRG内Nav1.8的表达增强。进一步说明TNF-α可能是运动神经损伤后引起Nav1.8表达上调的原因。