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研究背景:哮喘是一种严重的、累及全球所有年龄组患者的疾病。全球哮喘患病率逐年增加,特别是儿童人群[1]。调查研究显示:中国儿童哮喘患病率近20年来以每10年50%以上增幅上升[2]。过去20年中,全球针对哮喘恶化及控制每日症状的费用增加了30%,哮喘患病给人们工作、学习和生活带来巨大的影响[3]。因此进行哮喘防治研究有着重要现实意义。哮喘的治疗目前主要采取吸入激素治疗,但吸入激素不能治愈哮喘,只能控制哮喘。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)及欧洲变态反应与临床免疫学会(the European Academy of Allergy and Clinical Immunology,EAACI)推荐的变应原特异性免疫治疗(SIT,allergen-specific immunotherapy)是目前唯一针对病因有效的预防治疗[4]。近年来证实:Th1/Th2细胞失衡,尤其是Th2细胞的活化是哮喘发病的免疫机制中的关键环节;Th17细胞类细胞因子在哮喘尤其是中性粒细胞哮喘的免疫机制中发挥着重要作用[5];调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)具有抑制Th2细胞活性的功能,在哮喘的防治中占有重要地位[6]。免疫耐受是SIT中的重要环节,其中Treg起着关键作用,但其机制尚未完全阐明[7]。近年来研究发现色氨酸分解代谢的限速酶吲哚胺2,3双加氧酶(Indoleamine 2,3 dioxygenase,IDO)在外周免疫耐受中发挥着重要作用[8],可以介导T细胞抑制及Treg活化,在一定条件下是Th17细胞向Treg转换的分子“开关”[9],并且在变应原特异性免疫治疗中有助于气道免疫耐受的形成[10]。因此我们推测IDO介导的色氨酸代谢可能通过调控Treg/Th17细胞分化参与了哮喘免疫耐受形成。目的:1.建立小鼠哮喘免疫耐受模型并评价。2.探讨IDO调控Th17/Treg分化失衡在变应原特异性免疫治疗诱导哮喘免疫耐受的作用。方法:1.小鼠哮喘免疫耐受模型的建立及评价1)18只雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘免疫耐受模型组、哮喘对照组、正常对照组,每组6只小鼠。哮喘免疫耐受模型组小鼠予10μg OVA于0、7天腹腔注射致敏,21~25天持续5天予1mg OVA腹部皮下注射诱导免疫耐受,35、36、37天予1%OVA雾化激发,42天处死小鼠取材;哮喘对照组除了省去21~25天OVA腹部皮下注射诱导免疫耐受外,其余同哮喘免疫耐受模型组;正常对照组则使用等量生理盐水替代致敏及激发。2)哮喘免疫耐受模型评价末次激发24小时后用无创体积描记法检测各组小鼠气道反应性,42天处死小鼠取材,HE染色观察各组小鼠肺组织病理改变,细胞计数各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞比率,ELISA法检测各组小鼠外周血中OVA特异性Ig E、BALF中IL-4、IL-10的浓度。2.IDO调控Th17/Treg分化在变应原特异性免疫治疗哮喘诱导免疫耐受的作用。(1)实验分组:24只雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘免疫耐受组、哮喘组、正常对照组、哮喘免疫耐受+1-甲基色氨酸(1-methyl-DL-tryptophan,1-MT)组,1-MT为IDO抑制剂,每组6只。哮喘免疫耐受+1-MT组:予10μg OVA于0、7天腹腔注射致敏,21~25天持续5天予1mg OVA联合1-MT 2mg腹部皮下注射,35、36、37天予1%OVA雾化激发,42天处死小鼠取材;余建模及模型评价方法同前。(2)ELISA检测各组小鼠外周血中IL-4、IL-10、IL-17的浓度;流式细胞术检测各组小鼠外周血中Th17、Treg细胞占CD4+T淋巴细胞百分率情况。(3)高效液相色谱法检测哮喘免疫耐受组、哮喘组、正常对照组小鼠IDO活性。结果:1.成功建立哮喘小鼠免疫耐受模型动物行为学:哮喘免疫耐受模型组小鼠哮喘样症状较哮喘组对照组明显减低,较正常对照组小鼠加重。气道反应性:哮喘免疫耐受模型组小鼠气道反应性较哮喘对照组小鼠明显减低(p<0.05),但高于正常对照组。肺组织HE染色:哮喘免疫耐受模型组小鼠嗜酸性粒细胞增多等炎症反应较哮喘对照组小鼠明显减轻,但高于正常对照组。BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞比例:哮喘免疫耐受模型组小鼠明显低于与哮喘对照组小鼠(p<0.05),但高于正常对照组。外周血中OVA特异性Ig E、BALF中IL-4的浓度:哮喘免疫耐受模型组小鼠明显低于与哮喘对照组小鼠(p<0.05),但高于正常对照组。BALF中IL-10的浓度哮喘免疫耐受模型组小鼠明显高于与哮喘对照组小鼠(p<0.05),高于正常对照组。2.IDO调控Th17/Treg分化失衡参与了变应原特异性免疫治疗诱导哮喘免疫耐受。气道反应性检测:哮喘免疫耐受组气道反应性较哮喘组明显降低(p<0.05),但高于正常对照组;哮喘免疫耐受+1-MT组气道反应性较哮喘免疫耐受组明显增高(p<0.05),但低于哮喘组。肺组织HE染色:哮喘免疫耐受组肺组织炎性细胞浸润较哮喘组明显减轻,但较正常对照组加重;哮喘免疫耐受+1-MT组肺组织炎性细胞浸润较哮喘免疫耐受组明显加重,但较哮喘组减轻。BALF中细胞计数及分类计数:哮喘免疫耐受组BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞比率较哮喘组均明显降低(p<0.05),但均高于正常对照组;哮喘免疫耐受+1-MT组细胞总数及嗜酸性粒细胞比率较哮喘免疫耐受组均明显增高(p<0.05),但均低于哮喘组。ELISA检测小鼠外周血中OVA特异性Ig E及BALF中IL-4、IL-10、IL-17的浓度:哮喘免疫耐受组BALF中IL-4、IL-17浓度较哮喘组均明显降低(p<0.05),但均高于正常对照组;哮喘免疫耐受+1-MT组IL-4、IL-17浓度较哮喘免疫耐受组均明显增高(p<0.05),但均低于哮喘组。哮喘免疫耐受组BALF中IL-10浓度较哮喘组明显增高(p<0.05),较正常对照组增高;哮喘免疫耐受+1-MT组IL-10浓度较哮喘免疫耐受组明显减低(p<0.05),但高于哮喘组。流式细胞法检测小鼠外周血Th17、Treg占CD4+细胞的百分率变化:哮喘免疫耐受组Th17细胞比率较哮喘组明显减低(p<0.05),但高于正常对照组;哮喘免疫耐受+1-MT组Th17细胞比率较哮喘免疫耐受组明显增高(p<0.05),但低于哮喘组。哮喘免疫耐受组Treg细胞比率较哮喘组明显增高(p<0.05),高于正常对照组;哮喘免疫耐受+1-MT组Treg细胞比率较哮喘免疫耐受组明显降低(p<0.05),但高于哮喘组。高效液相色谱法检测小鼠外周血IDO活性:哮喘免疫耐受组IDO活性较哮喘组明显增高(p<0.05),高于正常对照组。结论:1.大剂量OVA连续皮下注射致敏小鼠成功建立了小鼠哮喘免疫耐受模型。2.哮喘发病中存在Th17/Treg失衡,SIT治疗哮喘诱导免疫耐受中Th17/Treg失衡得以逆转。3.IDO通过调控Th17/Treg分化可诱导哮喘免疫耐受,有望通过调控IDO表达诱导免疫耐受以防治哮喘。