沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)泌尿生殖道感染是一种常见的性传播疾病(STD)，近年来在世界范围内发病率呈上升趋势。女性生殖道Ct感染可引起宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎等严重后遗症从而造成不孕和异位妊娠，同时Ct的感染还能提高HIV传播的机率。虽然抗生素对沙眼衣原体早期泌尿生殖道感染有很好疗效，但由于无症状性衣原体感染普遍存在，给预防Ct的感染和并发症带来很大困难。因而有效地控制沙眼衣原体性传播疾病需依赖安全有效的疫苗的开发与应用。沙眼衣原体是一类专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，具有独特的生活周期，有两种形态和代谢差别很大的生活形式：其感染形式是原体(elementarybody，EB)，繁殖形式是始体(reticulate body，RB)。EB的外膜成分是衣原体致病性的决定因素，也是宿主免疫系统的主要靶分子。其中衣原体主要外膜蛋白(majorouter membrane protein，MOMP)能诱导宿主产生特异性体液免疫和细胞免疫，是Ct疫苗研究的主要靶抗原。但迄今为止，MOMP疫苗尚存在许多缺陷：免疫原性弱，诱导宿主产生抗体水平低，只能提供部分保护性免疫。近年来，国外学者进行了优化密码的研究，即用哺乳动物基因组偏爱密码取代低表达的病原生物基因的相应密码，密码改建后基因编码的氨基酸不变，蛋白表达水平显著提高。此类研究在某些病毒疫苗的研究中已取得较大进展，在某些原核生物中也有显著效果，但有关衣原体优化密码基因疫苗的研究目前国内外尚未见报道。在本课题组以往的研究中，我们以鼠型沙眼衣原体(C. muridarum，以往称为MoPn)为研究对象，自行设计合成了优化密码的主要外膜蛋白基因(HuMOMP，GeneBank accession NO．AY732495)，构建了MOMP基因真核表达质粒，证实了优化密码能够增强MOMP蛋白在体外培养哺乳动物细胞中的表达。本研究在以上工作基础上，通过小鼠动物实验进一步探讨了优化密码沙眼衣原体MOMP DNA疫苗的免疫作用。首先我们成功地培养，扩增及纯化了鼠型沙眼衣原体，建立了小鼠生殖道感染模型，为评价疫苗的保护性效果奠定了基础。然后采用肌内免疫方式免疫小鼠，比较了野生型及优化型MOMP DNA疫苗的免疫效果及对衣原体生殖道感染攻击的保护性。我们进一步对优化密码DNA疫苗的免疫途径及佐剂的添加等免疫条件进行了重新设计：采取滴鼻途径粘膜免疫，添加霍乱毒素B亚单位和CpG佐剂。研究结果显示此方案获得了较好的免疫效果及抵抗衣原体感染的保护作用。本研究为探索高效衣原体基因疫苗提供了新思路和实验依据，对于新型衣原体DNA疫苗的研究具有重要意义。一、鼠型沙眼衣原体的体外培养与纯化及小鼠生殖道感染模型的建立(一)、鼠型沙眼衣原体的体外培养、扩增与纯化我们在本实验室成功建立了鼠型沙眼衣原体体外培养与纯化的方法，为后续工作奠定了基础。人宫颈癌Hela229细胞用DEAE-葡聚糖处理后，感染一定剂量的鼠型沙眼衣原体，培养42-48小时衣原体即在细胞内形成包涵体，完成其生活周期，扩增产生大量具感染性的原体。收集衣原体感染的Hela229细胞，超声破碎细胞及衣原体包涵体壁，释放衣原体原体颗粒，经低温超速离心、泛影钠-泛影葡胺密度梯度离心分离纯化得到衣原体。在实验过程中，我们对鼠型沙眼衣原体在hela229细胞内扩增及此后的纯化的最佳实验条件进行了摸索。结果可在每175cm~2的细胞培养瓶中扩增纯化得到10~8IFU纯度较高的鼠型沙眼衣原体，从而为此后的实验工作打下基础。(二)、鼠型沙眼衣原体生殖道感染小鼠模型的建立建立在动物模型基础上的疫苗免疫效果的评定是疫苗研究进程中必不可缺的一步。鼠型沙眼衣原体是沙眼衣原体的鼠生物变种，以小鼠为天然宿主，有利于研究病原体与宿主间的相互作用。利用鼠型沙眼衣原体建立的小鼠生殖道感染模型在国内外均有应用。但根据不同的实验室报道，使用的衣原体滴度有很大差别。所以有必要在本实验室建立Ct小鼠生殖道感染模型，以便更准确地评价疫苗的免疫效果。本研究通过阴道内接种感染鼠型沙眼衣原体，建立Ct生殖道感染小鼠模型。通过采用不同数量的衣原体包涵体形成单位(IFU)感染小鼠，探讨建立生殖道感染模型的合适感染剂量。实验结果表明，使用10~5IFU经阴道感染6-8周龄雌性BALB／c小鼠即可造成输卵管阻塞和输卵管积水等并发症。在感染后不同时间，生殖道组织出现不同的病理改变，主要的病理改变包括：感染早期，生殖道粘膜层水肿，粘膜层上皮细胞灶性坏死，糜烂；粘膜及粘膜下层中性粒细胞浸润。后期以明显纤维组织增生，单核细胞浸润粘膜及粘膜下层为主要表现。小鼠Ct生殖道感染模型的建立为评价Ct DNA疫苗的免疫保护作用奠定了基础。二、肌内免疫裸DNA疫苗比较优化密码和野生型MOMP DNA疫苗的免疫效果通过优化密码促进外源蛋白在宿主细胞中的表达，增强DNA疫苗的免疫原性是提高DNA疫苗免疫效果的有效途径之一。这在某些病毒DNA疫苗的相关研究中已取得可喜进展(如HIV、HPV等)。通过优化密码提高某些细菌DNA疫苗(破伤风杆菌、李斯特胞内菌等)的免疫效果也已得到实验研究的证实。但目前，国内外尚未见到衣原体优化密码基因疫苗的研究报道。在本课题组以往的工作中，我们首次分析比较了鼠型沙眼衣原体和人、小鼠(大鼠)等基因组偏爱密码子的使用差异。根据人类基因密码子使用偏好对沙眼衣原体基因进行了优化，自行设计合成了优化密码鼠型沙眼衣原体MOMP基因。并成功构建了HuMOMP和野生型MOMP(WtMOMP)DNA疫苗。本研究在以上工作基础上，进一步进行动物免疫试验，研究优化密码是否提高沙眼衣原体DNA疫苗的免疫效果；并对优化密码影响沙眼衣原体MOMP DNA疫苗免疫效果的机制进行了初步探索。(一)、肌内免疫优化密码沙眼衣原体MOMP DNA疫苗免疫效果的研究采用肌肉接种免疫的方式探讨优化密码MOMP DNA疫苗的免疫作用。BALB／c小鼠分为四组：pcDNA3-HuMOMP免疫组、pcDNA3-WtMOMP免疫组、空载质粒阴性对照组和灭活衣原体原体阳性对照组。通过血清和生殖道局部抗体检测、细胞因子检测、迟发型超敏反应、脾淋巴细胞增殖试验，以及生殖道衣原体攻击试验来研究肌内免疫优化密码DNA疫苗的免疫效应。研究结果发现：1、HuMOMP基因免疫组小鼠的DTH平均值以及脾淋巴细胞增殖SI值均明显高于WtMOMP基因免疫组(P＜0.05)；说明优化密码MOMP DNA疫苗能增强免疫小鼠的特异性细胞免疫。细胞因子检测结果发现HuMOMP基因免疫组脾细胞培养上清中特异性IFN-γ水平显著高于WtMOMP基因免疫组(P＜0.05)，说明优化密码MOMP DNA疫苗能明显增强Th1类细胞免疫反应。2、小鼠血清特异性IgG抗体检测结果表明，与WtMOMP基因免疫组相比，HuMOMP基因免疫组IgG水平有所提高，体液免疫有一定程度的增强。但小鼠生殖道SIgA检测在各组小鼠中均显示为阴性结果。提示，经肌内途径接种MOMP DNA疫苗未能诱导生殖道粘膜产生特异性SIgA。3、生殖道衣原体攻击试验结果发现，与空载质粒对照组相比，HuMOMP基因免疫组小鼠对衣原体生殖道的攻击产生了部分保护作用，表现为生殖道衣原体定植减少，生殖道感染病理改变较轻。HuMOMP基因免疫组的保护作用强于野生型MOMP基因免疫组，但两者之间无显著差异。以上结果说明，优化密码能够增强沙眼衣原体MOMP DNA疫苗所诱导的细胞免疫和体液免疫反应水平，其中以Th1类细胞免疫反应增强为主；肌内途径免疫优化密码MOMP DNA疫苗对衣原体生殖道的攻击具有部分保护作用。(二)、优化密码增强沙眼衣原体MOMP DNA疫苗免疫原性的机制初探以上研究发现优化密码能够增强沙眼衣原体MOMP DNA疫苗的免疫效应，但其机制如何尚不清楚。为探讨优化密码DNA疫苗免疫效应的增强是否与抗原蛋白的表达有直接的关系，我们比较了优化密码与野生型MOMP基因在小鼠肌肉内的表达水平。提取各免疫组小鼠肌肉组织总蛋白，作Western blot分析，结果发现：优化密码基因组可见明显MOMP蛋白条带(约40KD)，而野生型基因组在相应分子量位置没有肉眼可见的蛋白条带，说明优化密码增强了MOMP蛋白在小鼠体内的表达水平。HuMOMP DNA疫苗免疫效果的增强与密码修饰增加了MOMP蛋白在细胞中的表达水平有直接关系。我们进一步探讨了优化密码增强哺乳动物细胞中衣原体蛋白表达的机制。采用荧光定量RT-PCR方法分析了HuMOMP基因和野生型MOMP基因在mRNA转录水平的表达。HuMOMP和WtMOMP基因转染COS-1细胞，提取总RNA，反转录cDNA为模板，以β-actin为内参照，荧光定量RT-PCR结果显示，优化密码MOMP基因的mRNA水平仅为野生型MOMP基因的1.36倍(而我们以往的研究结果证明优化密码MOMP基因的蛋白表达可增强至少10倍以上)。说明，在哺乳动物细胞内，此两种MOMP基因在mRNA的表达水平没有明显差异。这与大多数学者在优化密码相关研究(HPV6b E7，BPV L1等)中获得的结论相一致，即在哺乳动物细胞中，野生型基因与人源化基因在mRNA表达水平无明显差异，但在蛋白表达水平两者差异明显。提示，人源化优化密码基因蛋白表达增加的机制可能主要在转录后水平。具体哪些因素在转录后水平影响了MOMP蛋白的表达，我们将在以后的工作中进行深入研究。三、粘膜免疫优化密码MOMP DNA疫苗的免疫效果和霍乱毒素B亚单位及CpG基因佐剂的增效作用Ct感染后，细胞免疫和体液免疫共同参与针对Ct的特异性保护性免疫应答，CD4~+Th1细胞免疫反应在清除Ct感染中起重要作用。抗Ct MOMP SIgA的存在，减少了阴道感染率和相关的炎症反应，在防御Ct感染中具有明显作用。因此安全有效的Ct疫苗应引起Th1类反应占优势的保护性细胞免疫和强的粘膜SIgA反应。我们前一部分研究结果发现，沙眼衣原体MOMP DNA疫苗通过肌内途径免疫小鼠主要诱导Th1占优势的细胞免疫反应但不能诱导产生生殖道粘膜局部特异性SIgA，免疫保护作用不理想。因此，在本部分工作中我们进一步探讨了MOMP DNA疫苗的粘膜免疫作用，试图找到既能诱导Th1占优势的细胞免疫反应，又能产生生殖道粘膜局部SIgA抗体反应的免疫方式，以期获得更好的保护性免疫。霍乱毒素是迄今最有效的粘膜免疫佐剂之一，能诱导产生体液免疫，但其诱导产生的细胞免疫反应倾向于Th2型。CpG基因佐剂是比较新的一种能够诱导产生Th1型细胞免疫的粘膜免疫佐剂，并且具有调节免疫反应类型的作用。联合应用霍乱毒素和CpG做为蛋白疫苗粘膜佐剂在国外研究中已有成功报道，获得了较好的协同作用。但此两种佐剂联合应用，能否增强DNA疫苗的粘膜免疫效应尚不清楚。在本研究中我们采用无毒性但保留了粘膜佐剂作用的霍乱毒素B亚单位(CTB)和CpG共同做为佐剂，通过滴鼻的方式研究优化密码MOMPDNA疫苗的粘膜免疫效果。实验动物分组为：以CTB和CpG为佐剂的HuMOMP DNA疫苗组和空载质粒组，单独HuMOMP DNA疫苗免疫组，以及PBS空白对照组和接种活Ct原体的阳性对照组。免疫方式：鼻腔粘膜免疫。通过血清和生殖道局部抗体检测、细胞因子检测、迟发型超敏反应、脾淋巴细胞增殖试验，以及生殖道衣原体攻击试验来研究优化密码DNA疫苗的免疫效应和保护性作用。研究结果发现：1、CTB和CpG为佐剂的HuMOMP DNA疫苗免疫组小鼠(1)Ct特异性细胞免疫明显增强，其中以Th1类细胞免疫占主要优势(IFN-γ明显升高(2037.03pg／ml)，为PBS组的136.5倍，为单独HuMOMP免疫组的3倍；IgG2a明显升高(OD值为0.98)，与Ct-EB阳性对照组相比无显著差异(1.30，P＞0.05)。(2)生殖道Ct特异性SIgA抗体升高(OD值为0.732)；与Ct-EB阳性对照组接近(0.88，P＞0.05)。(3)对Ct生殖道的攻击具有较强免疫保护作用，甚至与Ct-EB阳性对照组的保护作用水平相当。表现为Ct生殖道的定植明显减少、清除加快；感染后第12天仅有生殖道局部少量炎细胞浸润，未造成上行感染，输卵管、卵巢基本正常。2、单独优化密码HuMOMP DNA疫苗鼻腔接种只能诱导低水平的细胞免疫及体液免疫，对Ct生殖道的攻击的保护作用较低，感染后第12天阴道、子宫粘膜下有较多炎细胞浸润，输卵管壁增厚，有炎细胞浸润。以上结果说明，CTB和CpG佐剂能够显著增强优化密码MOMP DNA疫苗粘膜免疫的免疫效果：免疫小鼠产生以Th1类占主要优势的特异性细胞免疫及生殖道局部SIgA抗体反应；并能诱导与Ct-EB免疫小鼠相当的免疫保护作用，有效抵抗衣原体的生殖道攻击。综上所述，本研究分别自肌内及滴鼻免疫途径系统探讨了优化密码MOMPDNA疫苗的免疫效应，为新型沙眼衣原体MOMP DNA疫苗的研究及有效粘膜免疫佐剂的选择提供了新思路和实验依据。以上研究在国内外尚未见报道。