论文部分内容阅读
目的：利用过期的手工汇集的血小板来制备不溶性血小板膜(Infusible platelet membrane, IPM)颗粒,并初步探索IPM颗粒的止凝血功能。方法：从采供血机构获得的过期浓缩血小板经过差速离心去除红细胞、白细胞和血浆,用生理盐水悬浮,放入-70℃5小时(冻)、25℃恒温水浴温育2小时(融),反复三次冻融破碎血小板。经冻融破碎的血小板经离心洗涤除去破碎细胞所释放的内容物。随后,进行超声匀浆200个循环(2S,占空比1.4：0.6),获得大小较均一的IPM颗粒,保存于4℃。对其进行理化和功能检测：使用纳米颗粒分析仪测量IPM颗粒大小,扫描电镜观察颗粒形态,采用SDS-PAGE电泳鉴定IPM颗粒与血小板的蛋白条带的差异,使用流式细胞术检测IPM颗粒表面的糖蛋白受体,利用化学发光的方法来检测IPM颗粒凝血酶生成能力,最后通过流式细胞仪术检测IPM颗粒对血小板聚集诱导剂的聚集反应性。结果：通过冻融和超声相结合的方法制备的IPM颗粒大小为150rnm左右,圆形；电泳条带显示IPM颗粒与血小板蛋白条带的差异主要在分子量200-85KDa之间；表面含有糖蛋白GP Ⅰ bα (CD42b)、糖蛋白GP Ⅱb-Ⅲa (CD41/CD61)、血小板内皮细胞粘附分子(CD31)、P-选择素(CD62p);体外功能实验结果表明,IPM颗粒在瑞斯托霉素(Ristocetin)和Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅲ)诱导下能发生聚集。凝血酶生成实验证实,IPM能为凝血因子X酶复合物(Tenase complex)和凝血酶生成提供催化表面,参与凝血级联反应。结论：本研究采用冻融和超声相结合的方法,能够制备得到大小均一的IPM颗粒,颗粒表面保留了与止血功能相关的蛋白受体GP Ⅰ bα GP Ⅱb-Ⅲa, CD31和CD62p。在血小板聚集诱导剂的刺激下IPM颗粒可以发生聚集反应,初步表现为止血功能,根据本课题的研究结果,预测IPM颗粒有望成为一种新的止血剂。