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第一部分对高三尖杉酯碱作用靶蛋白的虚拟筛选目的:筛选出高三尖杉酯碱(HHT)可能的作用靶蛋白。方法:采用虚拟筛选中分子对接的方法,应用Autodock、MGLtools、Python等软件,以高三尖杉酯碱为配体,以文献报道过跟HHT作用相关信号通路的关键信号分子为受体,进行分子对接,根据对接后构象的自由能进行筛选。结果:(1)共将HHT与30个蛋白分子进行对接,其中对接构象能量最低的为smad3.(2)对分子对接以后的构象研究显示,HHT可能与smad3MH2结构域C端相结合。结论:smad3可能为HHT作用的靶分子。第二部分:高三尖杉酯碱对AML细胞株细胞靶分子smad3和TGF-β的作用研究目的:验证第一部分的结论,探索HHT与smad3的关系,HHT与TGF-β信号通路的关系。方法:采用MTT法检测HHT对AML细胞株的增殖抑制作用,以及转染smad3-shRNA前后HHT对U937细胞的作用;采用Western Blot检测HHT作用后smad3的改变、细胞核内smad2/3和smad4的改变、周期相关蛋白的改变及转染后目的蛋白的改变;采用免疫荧光的方法检测HHT作用后,smad4蛋白细胞内定位的改变;流式细胞术检测HHT作用后,细胞凋亡和周期情况;采用慢病毒转染smad3-shRNA,降低U937内smad3蛋白的表达;集落形成实验检测HHT对转染前后细胞集落形成能力的影响。统计学分析,单一变量两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。以p<0.05认为具有统计学意义。结果:(1)HHT可促进smad3 ser423/425位的磷酸化。(2)HHT可促进smad4进入细胞核,使核蛋白中smad2/3和smad4含量增加。(3)HHT作用于U937细胞后,细胞凋亡无明显改变,细胞周期出现G1期阻滞。并有c-myc、p15、CDK4/6等蛋白的改变。(4)使用慢病毒载体将smad3-shRNA转染进入U937细胞后,smad3蛋白量减少,HHT对转染后的U937细胞24h的IC50值增加。G1期阻滞减弱。转染后,在相同HHT浓度下,smad3-shRNA-U937细胞能比U937形成更多的集落。(5)在U937细胞中,HHT通过周期阻滞而非诱导凋亡来抑制细胞增殖,而在另一种AML细胞株KG-1中,HHT通过诱导凋亡来抑制细胞增殖,对周期无明显影响。结论:(1)HHT能通过ser423/425位点磷酸化激活smad3。(2)HHT能通过激活smad3激活TGF-β信号通路。(3)HHT对细胞周期的阻滞及引起相关蛋白的改变符合TGF-β信号通路激活的表现。(4)慢病毒转染降低U937细胞内smad3表达后,U937细胞对HHT敏感性减弱,周期阻滞减弱。转染后的细胞在集落形成方面对HHT敏感性也减弱。(5)HHT对不同AML细胞作用具有异质性,与TGF-β的异质性相符合。(6)Smad3和TGF-β信号通路为HHT潜在的靶蛋白和靶向通路.第三部分初发急性髓系白血病患者smad3表达与预后关系的探讨目的:检测临床初发AMIL标本中,smad3的mRNA表达水平,探讨smad3的表达水平与患者临床预后及其他临床指标之间的关系。方法:收集临床初发AML患者骨髓标本,用人淋巴细胞分离液分离收集患者单个核细胞,Trizol裂解细胞,提取总RNA并逆转录。用实时荧光定量PCR的方法检测smad3基因的表达。用普通PCR和Sanger测序法检测基因突变,用Kaplan-meier法分析患者生存情况,Cox回归模型探讨smad3及其他各因素与患者预后的关系。认为p<0.05具有统计学意义。结果:(1)smad3高表达组与低表达组相比,患者具有更好的OS和EFS(p值均小于 0.05)(2)Cox回归模型中,smad3表达与患者的OS密切相关。结论:smad3为初发AML患者OS的独立预后因素。