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β-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业产生中的负面影响，但热稳定性已成为影响β-葡聚糖酶应用的主要因素。本文从菌种分离选育入手，研究了菌株产酶特性并诱变筛选出高产酶的地衣芽孢杆菌ZJU0107，采用均匀设计优化了该菌株产酶培养基和培养条件，分离纯化了β-葡聚糖酶，揭示了纯化酶的酶学性质及酶促反应动力学，探索出该酶双水相纯化和超滤浓缩酶液工艺，并利用酶制口在啤酒厂麦芽糖化过程中进行了应用示范。主要研究结果总结如下： 菌种筛选与产酶培养基及发酵条件优化 土壤分离菌株地衣芽孢杆菌Bacillus lichniformis ZJU0105所产β-葡聚糖酶的最适温为60℃，在较宽适温范围内有较高活性，最适pH 6.0，在pH 5.0-7.0范围内酶活性较高。经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变，突变株ZJU0107 β-葡聚糖酶产酶水平明显提高，为出发菌株的2.44倍。经单因素试验和均匀设计试验确定发酵产酶培养基的最佳配方为（g／L）：麸皮14.1，工业鱼粉8，硝酸钾3.4，硫酸镁1.1。最佳发酵产酶条件为36℃，起始pH 6.0，含胞量为108个／mL的种子菌液3.3％，培养时间为50～56 h。在此条件下β-葡聚糖酶产酶水平达到115 U／mL。 地衣芽孢杆菌ZJU0107 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的产生与菌体生物量和菌体生长状态密切相关，其产酶水平随菌体生长逐渐增高，并且受大麦β-葡聚糖诱导，提高发酵产酶水平的关键是提高菌体生物量和解除葡萄糖效应。此外，ZJU0107在产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶的同时，还产生木聚糖酶和中性蛋白酶，在菌体生长期，三种酶活性均随生物量增加而提高，当菌体生长进入对数生长后期至稳定期，三种酶开始大量表达。 β-葡聚糖酶的纯化和酶学性质 通过硫酸铵盐析沉淀、Sephadex G-100和DEAE-Sephadex A-50柱分离纯化地衣芽孢杆菌ZJU0107的β-葡聚糖酶，在此基础之上研究了其酶学性质和酶促反应动力学。结果显示，该β-葡聚糖酶具有严格的底物专一性，只水解含有β-1,3和β-1,4键的β-1,3．1,4-葡聚糖，但不水解仅含有β-1,3或β-1,4键的β-葡聚糖底物，显然系内β-1,3．1,4-葡聚糖酶（E.C.3.2.1.73）。 经凝胶电泳确定β-葡聚糖酶的分子量为31 kDa，等电聚焦法确定其等电点为9.1。纯化β-葡聚糖酶的最适反应pH 5.5，在pH 5.0～10．0范围内放置5 h酶活损失不大，剩余相对酶活力达80％以上，显示良好的pH稳定性；其最适反应温度为60℃，而在60℃以下酶活性随温度上升而提高；当反应温度超过70℃，则酶活性随温度上升而剧降。 β-葡聚糖酶活性受金属离子影响，Fe3+和Al3+对其活性有抑制作用，但K+、Na+、热稳定性p一葡聚糖酶的研制及其在啤酒生产中的应用MnZ+及Mg2+的影响不大;而Fe2+、c了十及ca2+，尤其是c了‘，对其有明显激活作用。 ZJU01O76一葡聚糖酶降解大麦B一葡聚糖和地衣多糖底物的动力学符合B一H方程。当以大麦B一葡聚糖为底物时，其动力学参数瓜二3.855m目mL，Vmax二0.1248mghaUinin，方程为价一0.1248c:/（ 3.855+C，）;而以地衣多糖为底物时，瓜二6.351m岁mL，Vmax=o·1951m留mUmin，动力学方程为气二0·1951c:/（6·351+c，）。 酶提取工艺通过对ZJU0107发酵液和上清液中B一葡聚糖酶、木聚糖酶和中性蛋白酶在PEG/磷酸盐体系中分配行为的研究，发现PEG分子量和PEG浓度对B一葡聚糖酶分配和萃取的影响很大。在该体系中选用高分子量的PEG（PEG6以刃）有利于B一葡聚糖酶的分离和纯化。体系pH影响6一葡聚糖酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的分配，可能与H2P04一和HP04z一在上下相间的不平衡分配有关。在体系中添加Nacl也会对酶的分配有很大影响。添加Nacl有利于木聚糖酶和中性蛋白酶向上相转移;由于B一葡聚糖酶、中性蛋白酶和木聚糖酶的疏水性等差异，上相萃取它们所需的NaCI浓度不同。 经研究确定，适宜B一葡聚糖酶分离的双水相体系含16%PEG 60(刃、12%NaHZP认-及HPo4、0.5%Nacl及pH 7.0。全发酵液三种酶的分配行为与发酵上清液中酶的分配行为相似。用两步法纯化B一葡聚糖酶，酶的回收率为79.17%，酶活力为597.75 U/mL为原发酵液酶活力的5.犯倍。此法比传统方法简便且效率高，而且发酵液中的木聚糖酶和中性蛋白酶也能很好地分离开来，但试剂较贵，用于工业化生产显得成本过高。 运用超滤方法浓缩发酵酶液，在体积浓缩4.76倍的情况下，p一葡聚糖酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活分别被浓缩3.66、3.77和3.91倍，相应的收率分别达到76.88%、79.19%和82.01%。浓缩过程中不出现相的变化，且工艺简，收率高，啤酒生产必须的木聚糖酶和中性蛋白酶也从发酵液中一并得到浓缩，故该方法适用于工业化生产。 卜葡聚糖酶在啤酒生产中的应用示范通过与诺维信公司同类产品Cerem议6.0L在啤酒生产中的对比试验，按0.2公斤/吨添加制作的刀uo107日一葡聚糖酶，在协定糖化试验中能明显降低麦汁粘度、过滤速度和B一葡聚糖含量，B一葡聚糖的分解率达60%以上，对不同的麦芽具有相同的效果。在放大示范试验中应用，麦汁酿制过程正常，组份合理，B一葡聚糖含量仅为65.4 mg/L，且非生物稳定性良好。这表明本研究?