论文部分内容阅读
目的体外培养正常成人皮肤成纤维细胞,并对成纤维细胞进行鉴定,观察川芎嗪,苦参碱,积雪草甙对正常成人皮肤成纤维细胞增殖的影响以及对其自分泌转化生长因子β1的影响。方法:1取正常成人包皮,用组织培养法进行成纤维细胞原代培养。2鉴定成纤维细胞:(1)形态学观察:将成纤维细胞用0.25%胰酶消化,制成单细胞悬液,细胞爬片,乙醇固定,镜下观察细胞的形态特征。(2)免疫组织化学鉴定:取上述细胞爬片,免疫组织化学测定细胞波形蛋白和角蛋白表达的情况。3以不加药的含10%的胎牛血清的DMEM培养液为对照组,设苦参碱,川芎嗪,积雪草甙3个加药组,各设5个不同的浓度,加入培养的皮肤成纤维细胞中进行培养,于24小时,48小时后在倒相差显微镜下摄像,并且作MTT,在酶标仪上进行检测OD值。4同上分组,培养24小时后分别取细胞上清液用ELISA方法测定细胞上清液中TGF-β1的含量。5乳酸脱氢酶(LDH)活性测定,同上分组,取上述细胞上清液,用自动生化分析仪测定,测定对照组LDH的含量。6统计所有数据均以x±s表示,采用单因素方差分析(one-wayNAOVA),两两比较用LSD检验,应用SPSS11.0统计软件处理。检验水准P＜0.05为差异有显著性。结果1人成纤维细胞形态学观察及鉴定:HE染色后光镜观察显示细胞为多角形或长梭形。波形蛋白免疫细胞化学染色显示成纤维细胞胞浆染成深棕色,为阳性。2成纤维细胞形态学变化对照组镜下可见外形狭长、胞核呈梭形、走向趋于一致的细胞,多呈平行排列并有一定弧度。细胞中央有圆形或卵圆形核,部分细胞可见向外伸出2-3个长短不一的突起,为成纤维细胞。随着培养时间的增加,细胞数量增多,细胞间隙变窄,呈条索状分布。积雪草甙实验组:当药物浓度为0.25mg/ml时,24小时后细胞就变短,出现少许脱壁、漂浮的细胞。在这个时间段内,随着培养浓度的增加,贴壁细胞数量进一步减少,细胞间隙变大,培养液中成形的细胞少见。当药物浓度达到2.5mg/ml时细胞即变圆,大量细胞漂浮于培养液中。苦参碱实验组:当药物浓度为0.5mg/ml时,在24小时个时间段内,随着培养浓浓度的增加,细胞数量减少,细胞梭状突起回缩,与邻近细胞接触减少,细胞间隙变大,形态逐渐变圆、脱壁。当药物浓度达到5mg/ml时,48小时后细胞变圆,大量细胞漂浮于培养液中。川芎嗪实验组:在24小时时间段内,当药物浓度为0.5mg/ml时,随着培养浓浓度的增加,细胞数量减少,细胞梭状突起回缩,与邻近细胞接触减少,细胞间隙变大,形态逐渐变圆、脱壁。当药物浓度达到5mg/ml时,24小时后细胞即变圆,大量细胞漂浮于培养液中。3各组中药培养24小时后,取细胞上清液,用Elisa方法测定细胞上清液中TGF-β1的含量.各组中TGF-β1的OD值均很低,与对照组经统计学处理无显著性差异(P＞0.05)4一定浓度下的积雪草甙,苦参碱,川芎嗪对成纤维细胞LDH活性的无影响。结论在一定浓度下,积雪草甙、苦参碱,川芎嗪具有抑制正常成人皮肤成纤维细胞生长的作用.但不影响成纤维细胞自分泌TGF-β1,正常人皮肤成纤维细胞自分泌的TGF-β1含量很少。