染色体5q31区Graves病易感基因的研究和中国汉族人单倍型域的构建目的Graves病(Graves disease，GD)是一种常见的自身免疫性疾病，遗传学因素在其发生过程中起着重要的作用。Graves病的发生呈明显的家族聚集性，病人家族成员的患病危险性为普通人群的15倍，同卵双生子的患病一致率明显高于异卵双生子，且作为自身免疫性甲状腺病(Autoimmune Thyroid Disease，AITD)标志的甲状腺自身抗体的阳性率在病人家族成员中高达50-70％。对复杂多基因疾病易感基因的研究常参照单基因疾病的研究模式，即基于家系成员的连锁分析和基于随机人群的关联研究。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因组序列上的单个碱基突变。作为第三代遗传学标记，SNP在疾病易感基因的研究中有着重要的意义，尤其是处于基因调控区或基因编码区的SNPs本身可直接导致编码蛋白质数量或质量的改变。最近的研究表明，人类基因组中的SNPs并不是随机分布的，而是呈现出由重组热点区间隔的单倍型域结构(haplotype block，HaploBlock)，每个单倍型域内部连锁不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)程度较高，且仅有数种常见的单倍型。如果导致疾病发生的突变位于LD程度很高的单倍型域内，那么该突变的频率应该与该区域内所检测的突变的频率相一致，或至少与由检测的SNPs确定的单倍型的频率一致。本研究所的金迎等人曾利用54个北方汉族多发家系标本通过全基因组扫描的方法，将中国人GD病的易感位点定位于染色体5q31区(D5S436-D5S434)，这与日本学者Sakai等人对受累同胞对的研究结果相一致，但与Tomer等人对西方高加索人群的结果存在差异，这提示，东亚人群可能有着相同的Graves病易感位点。本研究的目的就在于在染色体5q31区附近对Graves病的易感位点进行深入研究，探讨可能与Graves病发生有关的相关基因或SNPs位点，并研究在特定SNPs位点不同基因型患者临床参数差异。同时，构建中国汉族人群染色体5q31区的单倍型域结构，确定其中具有代表性的tagSNPs，并比较Graves家系先证者与正常个体主要单倍型分布上的差异，为今后的研究奠定基础。材料与方法为了进一步探索Graves病的易感位点，我们在染色体5q31区Graves病易感位点定位区域对IL4、IL13、IL12B、IRF1、UGRP1等可能与Graves病发生有关的14个候选基因的所有编码区和约1，000bp的启动子区进行了测序，筛查其中的SNPs，并对在筛查中可能存在差异的SNPs位点在扩大的家系样本或随机人群中进行验定。根据目前对Graves病发病机制的认识，我们对上述候选基因中的IL4、IL13、IL12B、IRF1、UGRP1和ADRB2等基因进行了系统深入的研究，包括扩大样本的关联研究、构建单倍型域、家系内的传递不平衡检验和不同基因型患者临床参数的比较。我们还从D5S436和D5S434这两个微卫星标记之间，挑选了74个低频等位基因超过20％，且位于基因编码区或启动子区周围的SNPs，通过焦磷酸测序的方法，构建中国汉族人群这段染色体区域的单倍型域结构，并确定其中具有代表性的tagSNPs，为下一步的深入研究奠定基础。结果对染色体5q31区14个Graves病候选基因的筛查，测序总长度为63，498bp，共发现116个SNPs，其中基因编码区17个，基因调控区35个。约每550bp碱基出现一个SNP，基因调控区或内含子区的SNPs的密度高于基因编码区。检出的116个SNPs中，转换与颠换的比例约为2：1。对IL12B和ADRB2较大样本的研究表明，IL12B基因的rs2853697 A／C SNP在GD患者与正常个体间的分布存在统计学差异(P=0.0024，Pc=0.0168)，其余位点未发现差异。我们利用54个GD多发家系标本、146名散发GD患者和142名无关对照个体，对IL4、IL13、IRF1和UGRP1与中国人GD的发病进行了研究，结果表明，无论是随机样本还是家系成员中，均未发现这些基因的SNPs与Graves病的发病之间具有统计学的相关性或从杂合型父母向受累子代的优势传递。对IRF1和UGRP1基因的单倍型研究也未发现差异，但在IRF1 6477 T／G位点，基因型为TT的Graves病患者的发病年龄为37.73±11.69岁，要早于基因型为TG(42.16±13.75)或GG(43.24±15.20)的患者，且具有统计学意义(P=0.005，Pc=0.020)。对染色体5q31区(D5S436-D5S434)构建单倍型域的结果表明，这段染色体区域可以分为8个独立的单倍型域结构，最长的单倍型域长达77kb。在每个单倍型域的内部，染色体的重组事件发生较少，仅含有少数(1-4)几种主要的单倍型。而且，每个单倍型域的结构，可以通过少数几个具有代表性的tagSNPs来决定。这表明，在今后的研究中，可以仅通过对这些tagSNPs进行分型，即可确定待测样本的整个单倍型域结构。而且，在第6个单倍型域中的AGCGTC单倍型和第8个单倍型域结构中的GGCCT单倍型在GD多发家系的先证者和正常个体间的分布具有统计学差异(P值为0.0064和0.0274，前者校正后为Pc=0.0256)。结论1、筛查的14个候选基因中SNPs的频率约为每550bp一个，启动子区和内含子区出现频率较高，SNP中转换与颠换的比例约为2：1。2、IL12B的rs2853697位点可能与中国人Graves病相关联。3、ADRB2基因与中国人Graves病并不具有相关性。4、IL4、IL13、IRF1和UGRP1基因与中国汉族人GD的发生并不具有相关性。5、在IRF1 6477 T／G位点基因型为TT的GD患者的发病年龄要早于基因型为TG或GG的患者。6、中国汉族人群的染色体5q31区的D5S436-D5S434具有典型的单倍型域结构，其中最长的单倍型域长达77kb。在每个单倍型域结构的内部，染色体的重组事件较少发生，仅含有少数几种主要的单倍型。且每个单倍型域的结构可以由少数几个具有代表性的tagSNPs来确定。7、第6个单倍型域中的AGCGTC单倍型和第8个单倍型域中的GGCCT单倍型在Graves病家系先证者和正常对照个体间的分布存在统计学差异。