miRNAs(microRNAs)是一类在真核生物中发现的非编码小RNAs分子,他们能够通过下调靶标mRNA的表达来调控生长发育进程,此外,植物中miRNAs还参与了对环境胁迫的应答反应。尽管拟南芥中已经发现了大量的miRNAs分子,但水稻作为单子叶模式植物和重要的经济作物,其miRNAs的发现以及它们的调控功能还处于探索阶段,尤其是与环境胁迫相关的miRNAs的发现及功能研究仍知之甚少。　　 为了获得与环境胁迫相关的miRNAs分子,我们构建了水稻幼苗的smallRNA库,包括ABA(abscisic acid)、寒冷、干旱、高盐处理以及未处理的对照组,克隆测序后得到约3900个长度在16-28 nt的小分子cDNA序列。通过对小分子cDNA序列信息的分析,排除已知miRNAs序列,预测出76个水稻候选miRNAs。采用植物miRNA芯片排除了45个低丰度候选miRNA,利用northernblot杂交的方法对剩余31个候选miRNA进行验证,对产生～21 nt小RNA信号的候选miRNA再进一步通过OsDCL1鉴定。由于DCL1是miRNA合成途径中的关键酶,它的缺失会导致miRNA无法形成,因此在水稻OsDCL1中无法检测出的小RNA则被认为是miRNA,结果表明,在候选miRNA中共分离获得了7个新的水稻miRNAs。通过分析这7个miRNAs在环境胁迫下的表达模式,发现有3个miRNAs受干旱胁迫诱导高表达,2个miRNAs受盐胁迫诱导高表达,有1个miRNA受两种胁迫(ABA和盐)诱导高表达,还有1个miRNA的表达受寒冷和干旱胁迫的影响。对miRNAs基因上游序列的分析表明7个新miRNAs的启动子区均有与胁迫相关的顺式应答元件。miRNAs在环境胁迫下的表达模式研究及启动子区顺式作用元件的分析表明这7个新的miRNAs可能参与了水稻对环境胁迫的应答反应。　　 利用生物信息学的方法对miRNA的靶基因进行预测,得到了42个候选靶基因。通过MPSS(Massively Parallel Signature Sequencing)分析候选靶基因在环境胁迫下的表达模式,与相应miRNA在环境胁迫下的表达模式比对,依据miRNA对靶基因表达的调控模式,确定了3个可能受miRNA调控的候选靶基因,OsDCL1全基因组芯片的数据也支持这一结果。这些结果表明水稻中新的miRNAs可能通过调节靶基因的表达对环境胁迫进行应答。　　 鉴于miR2006的表达受环境胁迫诱导,具有组织特异性,且表达随着处理时间梯度变化；我们对其进行了相关功能研究。RT-PCR及northern杂交结果显示miR2006的前体及成熟的miRNA分子在过表达miR2006的转基因植株中高表达。正常生长条件下转基因植株表型与转空载体对照植株相比没有明显差异,但转基因种子在100 mM盐胁迫处理下,萌发后的根长比对照短,表现出对盐的敏感性。转基因幼苗体内脯氨酸含量约为对照组的1/2,表明转基因植株具有较低的环境耐逆性。离子流测定结果表明转基因植株在受到100 mM盐长时胁迫处理后,会排出K+吸收Na+,使植株对盐胁迫更加敏感。在过表达miR2006的植株中检测ABA或盐信号通路中相关基因的表达,发现胁迫诱导基因LIP9在转基因植株中高表达。同时,分析芯片结果发现存在两个与脯氨酸合成相关的酶基因,它们的表达受miR2006影响,影响脯氨酸的合成。此外,我们发现miR2006可能是在转录后水平抑制靶基因的翻译而不是切割靶基因或者存在其他的反馈通路使靶基因的表达保持稳定状态。上述结果证明miR2006的高表达影响了脯氨酸合成通路中酶基因的表达,促使水稻对盐胁迫产生应答,造成植株对盐胁迫更加敏感。