论文部分内容阅读
第一部分协同信号分子CD40-CD40L在结肠癌的表达及对结肠癌细胞的体外抑制作用目的研究协同信号分子CD40-CD40L在结肠癌的表达及对结肠癌细胞体外抑制作用。方法应用免疫组化技术(SP法)检测65例结肠癌组织和10例癌旁组织中CD40分子的表达,并分析CD40表达水平高低与临床病理特征的相关性,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和流式细胞分析技术分别检测4株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2、SW48和COLO-320)CD40分子的表达,同时利用流式细胞仪分析技术检测γ-干扰素(IFN-γ)对结肠癌细胞株CD40表达的影响。MTT法检测重组可溶性人CD40配体(rshCD40L)对结肠癌细胞的抑制作用,TUNEL法检测rshCD40L对结肠细胞的促凋亡作用,同时检测联合rshCD40L和IFN-γ抗结肠癌作用。结果免疫组化检测显示CD40分子阳性染色于细胞膜和细胞浆,在结肠癌组织高表达率为41.5%,在正常癌旁组织不表达(P < 0.05),CD40分子高表达与肿瘤TNM分级和淋巴结转移显著相关(P < 0.05);RT-PCR和流式细胞仪检测有3株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2和SW48)高表达CD40分子,IFN-γ能增强CD40~+结肠癌细胞CD40分子的表达。rshCD40L能明显抑制CD40~+结肠癌细胞的增殖作用(抑制率分别为HCT116:33.5±5.5%,Caco-2:21.5±3.6%,SW48:30.1±4.2%),而对CD40~-结肠癌细胞株(COLO-320)无明显抑制作用(P < 0.05)。rshCD40L能诱导CD40~+结肠癌细胞的凋亡作用(凋亡细胞百分比为HCT116:25.6±4.52%, Caco-2:15.71±2.27%,SW48:18.0±3.7%),而对CD40~-结肠癌细胞株(COLO-320)无诱导凋亡作用(P < 0.05)。另外,IFN-γ能明显增强rshCD40L对结肠细胞的抑制增殖和促凋亡作用。结论CD40分子在结肠癌发病过程中可能起重要的作用,重组人CD40L与IFN-γ联合可显著诱导CD40阳性的结肠癌细胞凋亡,抑制其增殖,具有潜在的抗肿瘤作用。第二部分CD40L刺激的DCs疫苗抗结肠癌作用目的研究趋化因子RANTES(正常T淋巴细胞活化后表达和分泌的调节蛋白)促进小鼠外周血树突状细胞(Dendritic cells, DCs)前体细胞动员,并在此基础上进一步研究CD40L刺激的RANTES动员的DCs疫苗对结肠癌细胞的体外杀伤作用。方法(1)RANTES通过尾静脉注射C57BL/6J(B6)小鼠,24小时后采集小鼠外周血,分离外周血单个核细胞(PBMNCs),用流式细胞仪分选出F4/80~-B220~-CD11c~+细胞,通过细胞形态学、表型和混合淋巴细胞反应,检测新鲜分离的B220~-CD11c~+细胞和经过细胞因子mGM-CSF、IL-4和mTNF-α培养后的B220~-CD11c~+细胞。(2)反复冻融法制备结肠癌可溶性抗原,将其联合CD40L与RANTES动员的DCs共同培养,制备成CD40L刺激的负载结肠癌抗原的DCs疫苗以激活T细胞,检测活化的T细胞在体外对结肠癌细胞的杀伤作用。结果(1)新鲜分离的B220~-CD11c~+细胞不具有成熟DCs的特征,经过细胞因子体外培养的B220~-CD11c~+细胞具有典型的DCs形态和表型,高表达MHCⅡ类分子(69.70±2.35%)、DEC-205(61.60±1.02%)、CD80(49.65±0.73%)、CD86(53.42±1.52%)和CD40(42.30±1.35%),不表达F4/80(0.45±0.09%)和CD8α(0.26±0.04%),在混合淋巴细胞反应中具有极强的刺激T细胞增殖的能力。(2)CD40L刺激的负载结肠癌抗原DCs激活的CTLs表现出对结肠癌细胞的特异性杀伤作用,产生高水平的IFNγ,且与未经CD40L刺激的DCs疫苗相比有显著性差异(P < 0.05);未负载结肠癌抗原DCs刺激的CTLs对结肠癌细胞无杀伤作用。结论应用趋化因子RANTES从外周血中诱导出的DCs负载结肠癌抗原后,激活的CTLs在体外对结肠癌细胞能产生特异性杀伤作用,联合CD40L能增强其CTLs的杀伤作用。