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马氏珠母贝(Pinctada martensii)主要分布于我国广东、广西、海南、日本、印度以及澳大利亚沿海,是目前海水珍珠养殖的主要贝类。本论文第一部分利用磁珠富集法构建了马氏珠母贝的基因组微卫星富集文库,并设计引物进行PCR筛选,获得了20个微卫星多态位点。选用其中的10个多态位点,对我国华南沿海四个马氏珠母贝养殖群体进行了遗传多样性分析。第二部分通过生物信息学的方法对马氏珠母贝的NCBI EST数据库进行分析,寻找免疫相关的基因。然后采用RACE方法获得了两个相关基因的全长cDNA序列,并使用实时定量PCR技术检测它们在不同的环境胁迫下的表达模式,为进一步研究这些抗逆基因的表达调控机制提供重要的基础信息。
1.本研究从磁珠富集文库的1000个克隆中筛选了含有微卫星的序列130个,富集率达到13％。在这130个微卫星序列中,108个为两碱基重复序列,4个三碱基重复序列,18个四碱基重复序列,其中完美型89.23%,非完美型3.85%,复合型6.92%。设计的70对微卫星引物中,有23对引物可扩增出清晰的微卫星条带,其中3个位点为单态,20个位点为多态;结果显示,等位基因个数范围为2～14,观测杂合度分布为0.083～0.882,期望杂合度分布为0.533～0.917,20个位点中经过顺序Bonferroni校正后有8个偏离哈迪-温伯格平衡定律,Pm45与Pm64,Pm14与Pm67,Pm58与Pm68连锁不平衡。
2.利用开发的10个多态位点,对我国华南沿海四个马氏珠母贝养殖群体进行了遗传多样性分析。结果表明,四个群体的杂合度较低,在所检测的40个数据组中(4个种群×10个位点),有31个偏离遗传平衡状态。分子方差分析显示马氏珠母贝养殖群体的绝大多数变异都存在于群体内部(94.49%),群体间的遗传差异仅为总变异的5.51%,养殖群体之间的遗传分化程度较低,且更接近于无分化范围。Nei(1972)遗传距离和UPGMA聚类分析研究结果表明,大亚湾养殖群体单独成一支,北海养殖群体和三亚养殖群体先聚在一起后,再与雷州群体聚在一起。
3.同种移植炎症因子-1(Allograft inflammatory factor-1 AIF-1)是一个具有EF-手形结构,由γ干扰素诱导的钙离子细胞因子。PmAIF-1 cDNA全长946bp,包括120bp的5-UTR,376bp的3-UTR和450bp的ORF编码149个氨基酸,分子量(MW)为17.1 kDa,等电点(PI)为5.7。多序列比对和系统进化分析显示不同物种来源的AIF-1氨基酸序列具有较高的保守性,暗示了它们在功能上的相似性。Real-Time PCR检测发现,PmAIF-1基因在所检测的马氏珠母贝的各种组织中均有表达,其中在淋巴细胞中的表达量最高。弧菌感染后,淋巴细胞中PmAIF-1基因mRNA表达水平显著上升,12h表达水平最高,随着时间的延长,表达量开始下降,表明PmAIF-1基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。在组织损伤后,淋巴细胞中PmAIF-1 mRNA的表达量也上调,表明PmAIF-1可能是一个免疫炎症反应的早期因子,参与了马氏珠母贝组织损伤修复。
4.PmHSP40 cDNA全长1251bp,包括75bp的5-UTR,513bp的3-UTR和663bp的ORF编码220个氨基酸,分子量(MW)为24.8kDa,等电点(PI)为7.8。SMART分析结果表明,Pm HSP40在N端2-61位有DnaJ结构域,在76-123有甘氨酸/苯丙氨酸富含区、同时还有一个保守的C末端,可能为Ⅱ型HSP40。经BLAST比对,Prrk-ISP40与其他物种的HSP40蛋白有较高的同源性。为了探讨PmHP40可能的生物学功能,我们采用Real-Time PCR方法对PmHSP40不同组织及高温胁迫、弧菌感染和低盐度胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,高温胁迫、弧菌感染和低盐度胁迫均能诱导马氏珠母贝淋巴细胞和腮中HSP40 mRNA转录水平显著增加,这种上调暗示其参与了马氏珠母贝的免疫反应。