论文部分内容阅读
[目的]探索基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinases 3, MMP3)基因启动子区多态与散发性脑动静脉畸形(Brain arteriovenous malformation, BAVM)的遗传易感性,并研究MMP3基因启动子区单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)的生物学功能。[方法]MMP3是基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMP)家族中的重要成员,具有降解细胞外基质的功能,参与血管重塑与再生,可能在BAVM的发生发展中起重要作用。本课题首先通过数据库检索,选择了5个在中国人群中高频分布的潜在MMP3基因功能性SNP位点,通过病例-对照进行研究。经检测319例BAVM患者和333例健康对照组的血液标本,确定了与BAVM发病相关的MMP3基因启动子区SNP位点-709A>G(rs522616)。其次,对该位点A>G突变降低BAVM发生风险的分子机制进行了探索。本课题采用构建含有-709A、-709G以及位点突变的pGL3-A、pGL3-G和]pGL3-mutant荧光素酶报告载体,分别转染HEK293和HUVEC细胞,检测荧光素酶活性,分析该SNP位点不同等位基因所导致的MMP3基因转录活性的不同。再通过添加含有-709A、-709G的竞争性DNA片段,分析pGL3-A受干扰后的转录活性,比较这两种等位基因与转录因子之间结合力的强弱。然后通过生物信息学软件确定与该MMP3基因启动子区SNP结合的转录因子为c-myb,并通过构建其过表达荧光素酶报告载体共转染、染色质免疫共沉淀和凝胶迁移实验,检测c-myb对MMP3基因转录活性的影响,并在BAVM组织中进行验证。[结果]通过分子流行病学调查,BAVM病例组与对照组在年龄和性别上分别匹配(p=0.062&0.945),没有统计学差异。在检索分析获得的5个SNP位点中,MMP3基因启动子区-709bp SNP位点rs522616A>G在BAVM病例和对照组中存在显著差异(P=0.02),携带rs522616AG杂合基因型的个体与AA基因型携带者相比,BAVM的患病风险降低了38%(Adjusted OR= 0.62,95% CI= 0.44-0.87, P= 0.006)。转录活性实验证实,在HEK293细胞中,G等位型的荧光素酶活性较A相比显著下降了2.67倍(P<0.01)；在HUVEC细胞中,G等位型也下降了5.89倍(P<0.05)。在竞争实验中,A比G竞争片段可以更大程度降低pGL3-A转录的荧光素酶活性(Aportion vs G portion=0.503-fold vs 0.756-fold, P=0.01)。提示A>G的突变降低了MMP3基因启动子区的转录活性以及与转录因子的结合力。通过生物信息学检测,发现在MMP3基因启动子区SNP rs522616周围6个碱基TTCAAT是转录因子c-myb的结合位点,在细胞水平上过表达c-myb,可以使得pGL3-A的荧光素酶活性在HEK293及HUVEC细胞中分别提高了1.7倍和1.2倍(P<0.05),而不能明显提高pGL-G的转录活性。染色质免疫共沉淀和凝胶迁移实验证实了在细胞系以及BAVM组织中,转录因子c-myb与包含-709A等位型的MMP3启动子区域结合更为紧密。[结论]本研究首次提出MMP3基因启动子区SNP -709 A>G (rs522616)可能可以降低BAVM的发病风险,该保护作用的机制在于-709 A>G的突变能减弱MMP3基因启动子与转录因子c-myb的结合能力,继而影响转录活性,从而减少MMP3基因的过表达。