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第一部分FZD5基因在肝内胆管细胞癌中的表达及意义
[背景]
肝内胆管细胞癌是第二常见的原发性肝癌。其恶性度较高，缺乏早期的诊断手段，大多诊断时即处于晚期而失去手术机会，亟需有效的靶向药物。Wnt/β-catenin信号通路的激活对肿瘤的增殖、侵袭和转移有着重要的作用。该信号通路的激活在肝内胆管细胞癌中非常普遍，并与肝内胆管细胞癌增殖和转移密切相关。FZD5蛋白是Wnt受体复合物的组成成分之一，既往的研究表明特异性结合FZD5和FZD8抗体能够有效抑制某些消化系统肿瘤的生长，提示其可能也是肝内胆管细胞癌的一个潜在的治疗靶点。但是FZD5对肝内胆管细胞癌发生发展及侵袭转移的作用仍不明确。本研究拟明确FZD5蛋白在胆管细胞癌的作用，为肝内胆管细胞癌的治疗提供新的思路。
[方法]
1.采用脂质体介导法将FZD5-siRNA转染肝内胆管癌细胞株RBE及HUCCT1，采用实时荧光定量PCR和Westernblot分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后FZD5的表达。
2.沉默FZD5基因，CCK-8法检测其对肝内胆管癌细胞增殖的影响，克隆形成实验检测其对细胞克隆形成能力的影响。
3.沉默FZD5基因，Transwell小室检测细胞的侵袭迁移能力。
4.沉默FZD5基因，Westernblot检测与细胞周期及EMT相关蛋白的表达。
5.设计针对FZD5基因所有转录本的Crispr/cas9敲除靶位点，分别构建基因敲除载体后，电转RBE细胞，进行基因敲除阳性克隆筛选。
6.流式细胞法检测FZD5基因敲除对RBE细胞周期的影响
7.基于RNA-Seq技术对RBE细胞FZD5敲除株进行转录组分析。
8.利用公共数据库探索胆管癌细胞中FZD5的表达，突变及其与预后的关系
9.利用公共数据库探索FZD5基因甲基化与FZD5表达的关系
[结果]
1.FZD5-siRNA转染肝内胆管癌细胞后，FZD5的表达明显受抑制，其mRNA和蛋白表达均受到明显抑制。
2.FZD5-siRNA转染后，细胞增殖速度减慢，克隆形成及侵袭迁移能力降低。
3.FZD5-siRNA转染后，细胞周期相关蛋白CyclinD1、C-myc及EMT相关蛋白ZEB1、Vimentin、Snail、N-cadherin表达降低。
4.构建RBE细胞FZD5基因敲除稳定细胞株，其G0/G1期细胞比例增加，G2/M期细胞比例减少，差异有统计学意义。
5.RNA-seq共发现敲除FZD5基因后共有1100个基因表达发生了改变。差异基因主要富集于细胞粘附分子、细胞外基质受体相互作用、和Rap1等信号通路上。
6.TCGA数据库显示胆管癌组织和正常对照的FZD5表达水平存在差异，MSK测序结果未发现位于FZD5基因的突变。
7.FZD5基因甲基化水平的改变可能导致了FZD5表达水平的变化。
[结论]
可通过抑制FZD5基因调控肝内胆管细胞癌增殖及侵袭迁移能力，其机制可能主要是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而下调细胞周期及EMT相关蛋白来实现。这将为我们在未来找到治疗肝内胆管细胞癌的最佳治疗方案提供帮助。
关键词:肝内胆管细胞癌;FZD5;Wnt/β-catenin信号通路;增殖;侵袭迁移
第二部分结直肠肝转移术前化疗前中性粒细胞/淋巴细胞比值与预后及化疗敏感性的关系
[背景]
中性粒细胞对淋巴细胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)是一种与不良预后相关的炎症标志物，本文的目的是评价化疗前NLR在预测接受术前化疗的结直肠肝转移(colorectal liver metastases，CRLM)患者预后及化疗敏感性中的作用。
[方法]
本文对183例CRLM患者进行回顾性分析。使用受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic，ROC)计算化疗前NLR的阈值。使用Logistic回归分析肿瘤病理缓解率的预测因素，并采用COX回归模型分析影响患者生存的因素。
[结果]
化疗前后的NLR分别为2.4±1.1及2.1±1.6(p＜0.001)。化疗前NLR≤2.3患者的病理缓解率为67.1％，NLR＞2.3患者的病理缓解率为48.1％(p=0.01)。多变量分析显示，与病理缓解相关的独立预测因素包括化疗前NLR≤2.3(p=0.043)，肿瘤影像学退缩(p＜0.001)，仅接受一线化疗(p=0.001)和接受靶向治疗(p=0.002)。NLR＞2.3患者的中位总生存期(overall survival，OS)和无复发生存期(recurrence free survival，RFS)差于NLR≤2.3组(OS:31.1vs.43.1个月，p=0.012;RFS:6.5vs.9.4个月，p=0.06)。根据多因素分析，化疗前NLR是OS(HR=2.43,95％CI=1.49-3.94,p＜0.001)和RFS(HR=1.53,95％CI=1.08-2.18，p=0.017)的独立预测因素。
[结论]
化疗前NLR升高是低病理缓解率和预后不良的重要预测指标。NLR可能是评估疗效的一种简单有效的生物标记物。
[背景]
肝内胆管细胞癌是第二常见的原发性肝癌。其恶性度较高，缺乏早期的诊断手段，大多诊断时即处于晚期而失去手术机会，亟需有效的靶向药物。Wnt/β-catenin信号通路的激活对肿瘤的增殖、侵袭和转移有着重要的作用。该信号通路的激活在肝内胆管细胞癌中非常普遍，并与肝内胆管细胞癌增殖和转移密切相关。FZD5蛋白是Wnt受体复合物的组成成分之一，既往的研究表明特异性结合FZD5和FZD8抗体能够有效抑制某些消化系统肿瘤的生长，提示其可能也是肝内胆管细胞癌的一个潜在的治疗靶点。但是FZD5对肝内胆管细胞癌发生发展及侵袭转移的作用仍不明确。本研究拟明确FZD5蛋白在胆管细胞癌的作用，为肝内胆管细胞癌的治疗提供新的思路。
[方法]
1.采用脂质体介导法将FZD5-siRNA转染肝内胆管癌细胞株RBE及HUCCT1，采用实时荧光定量PCR和Westernblot分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后FZD5的表达。
2.沉默FZD5基因，CCK-8法检测其对肝内胆管癌细胞增殖的影响，克隆形成实验检测其对细胞克隆形成能力的影响。
3.沉默FZD5基因，Transwell小室检测细胞的侵袭迁移能力。
4.沉默FZD5基因，Westernblot检测与细胞周期及EMT相关蛋白的表达。
5.设计针对FZD5基因所有转录本的Crispr/cas9敲除靶位点，分别构建基因敲除载体后，电转RBE细胞，进行基因敲除阳性克隆筛选。
6.流式细胞法检测FZD5基因敲除对RBE细胞周期的影响
7.基于RNA-Seq技术对RBE细胞FZD5敲除株进行转录组分析。
8.利用公共数据库探索胆管癌细胞中FZD5的表达，突变及其与预后的关系
9.利用公共数据库探索FZD5基因甲基化与FZD5表达的关系
[结果]
1.FZD5-siRNA转染肝内胆管癌细胞后，FZD5的表达明显受抑制，其mRNA和蛋白表达均受到明显抑制。
2.FZD5-siRNA转染后，细胞增殖速度减慢，克隆形成及侵袭迁移能力降低。
3.FZD5-siRNA转染后，细胞周期相关蛋白CyclinD1、C-myc及EMT相关蛋白ZEB1、Vimentin、Snail、N-cadherin表达降低。
4.构建RBE细胞FZD5基因敲除稳定细胞株，其G0/G1期细胞比例增加，G2/M期细胞比例减少，差异有统计学意义。
5.RNA-seq共发现敲除FZD5基因后共有1100个基因表达发生了改变。差异基因主要富集于细胞粘附分子、细胞外基质受体相互作用、和Rap1等信号通路上。
6.TCGA数据库显示胆管癌组织和正常对照的FZD5表达水平存在差异，MSK测序结果未发现位于FZD5基因的突变。
7.FZD5基因甲基化水平的改变可能导致了FZD5表达水平的变化。
[结论]
可通过抑制FZD5基因调控肝内胆管细胞癌增殖及侵袭迁移能力，其机制可能主要是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而下调细胞周期及EMT相关蛋白来实现。这将为我们在未来找到治疗肝内胆管细胞癌的最佳治疗方案提供帮助。
关键词:肝内胆管细胞癌;FZD5;Wnt/β-catenin信号通路;增殖;侵袭迁移
第二部分结直肠肝转移术前化疗前中性粒细胞/淋巴细胞比值与预后及化疗敏感性的关系
[背景]
中性粒细胞对淋巴细胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)是一种与不良预后相关的炎症标志物，本文的目的是评价化疗前NLR在预测接受术前化疗的结直肠肝转移(colorectal liver metastases，CRLM)患者预后及化疗敏感性中的作用。
[方法]
本文对183例CRLM患者进行回顾性分析。使用受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic，ROC)计算化疗前NLR的阈值。使用Logistic回归分析肿瘤病理缓解率的预测因素，并采用COX回归模型分析影响患者生存的因素。
[结果]
化疗前后的NLR分别为2.4±1.1及2.1±1.6(p＜0.001)。化疗前NLR≤2.3患者的病理缓解率为67.1％，NLR＞2.3患者的病理缓解率为48.1％(p=0.01)。多变量分析显示，与病理缓解相关的独立预测因素包括化疗前NLR≤2.3(p=0.043)，肿瘤影像学退缩(p＜0.001)，仅接受一线化疗(p=0.001)和接受靶向治疗(p=0.002)。NLR＞2.3患者的中位总生存期(overall survival，OS)和无复发生存期(recurrence free survival，RFS)差于NLR≤2.3组(OS:31.1vs.43.1个月，p=0.012;RFS:6.5vs.9.4个月，p=0.06)。根据多因素分析，化疗前NLR是OS(HR=2.43,95％CI=1.49-3.94,p＜0.001)和RFS(HR=1.53,95％CI=1.08-2.18，p=0.017)的独立预测因素。
[结论]
化疗前NLR升高是低病理缓解率和预后不良的重要预测指标。NLR可能是评估疗效的一种简单有效的生物标记物。