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研究背景随着人口老龄化和人们生活水平的不断提高,我国糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率和死亡率呈直线上升,极大地危害着国人的身心健康。DM伴随着自主神经系统功能紊乱,尤其是副交感神经系统活性减弱与DM合并心血管疾病有着密切关系。DM患者出现心脏和血管舒缩功能异常和血糖、血脂的增高而升高血液黏度,加重动脉硬化的程度,进而促发多种心血管并发症的发生。赤芍苷(paeoniflorin,Pae)是我国传统中药赤药的主要活性单体成分之一,通过抗炎、抗氧化及内皮依赖性舒张血管等作用参与其对心血管系统的保护作用。目前关于赤芍苷对DM大鼠心血管病变的改善作用及机制尚不十分明确。目的本研究以副交感神经系统为切入点,探讨赤芍苷对DM心血管功能的改善作用及机制,为DM心血管疾病的防治提供实验依据。方法1.DM大鼠模型的建立:以高脂饲料喂养45天,腹腔注射链脲佐菌素(30 mg/kg),监测血糖,3天及7天后均空腹血糖≥16.7 mM为DM造模成功。继续高脂饲料喂养45天后进行实验。2.赤芍苷干预方式及实验分组:分别给DM大鼠开始灌胃赤芍苷和二甲双胍(metformin,Met)并维持4周,进行干预实验。实验分六个组,即对照组、DM组、赤芍苷(50 mg/kg)+DM组、赤芍苷(100 mg/kg)+DM组、赤芍苷(200 mg/kg)+DM组、二甲双胍(200 mg/kg)+DM组。3.采用血糖仪检测大鼠的血糖水平;采用全自动生化分析仪测定大鼠的血脂水平;利用放射免疫法检测血浆中心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)和内皮素(endothelin,ET)水平;利用硝酸还原酶法检测血浆中一氧化氮(nitric oxlde,NO)水平。4.将监测器套入需要检测的大鼠根部,待其状态稳定后,用无创尾动脉血压检测系统测试大鼠血压。5.利用HE染色和甲苯胺蓝染色技术观察心脏和血管组织形态学。6.检测大鼠心房动力及ANP分泌水平:利用离体大鼠心房灌流和BL-420S生物机能实验系统进行实验,测量大鼠心房内压并接取心房灌流液;使用放免试剂盒通过放免γ测量仪测试ANP的分泌水平。处死大鼠后,取出心脏,剪取左心房,固定于心房灌流装置上,使心房内外都浸于HEPES缓冲液中,给予电刺激,接上生物机能记录仪进行试验。先使心房稳定90 min,再用缓冲液配制乙酰胆碱(acetylcholine,ACh),泵入大鼠左心房中,并每2分钟接取样品待测。7.采用MTT法观察人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)存活率的影响。8.检测大鼠胸主动脉张力变化:用离体血管环实验装置和BL-420E生物机能实验系统,观察ACh调节胸主动脉环血管张力的作用。结果1.与对照组比较,DM组大鼠血浆中血糖、甘油三酯、总胆固醇和同型半胱氨酸水平均明显升高(P<0.05);与DM组比较,赤芍苷+DM组大鼠血浆中血糖、甘油三酯、总胆固醇和同型半胱氨酸水平均明显降低(P<0.05)。2.与对照组比较,DM组大鼠血浆中ANP、Ang II和ET-1水平明显升高而NO水平则明显降低(P<0.01);与DM组比较,赤芍苷+DM组大鼠血浆中ANP、Ang II和ET-1水平明显降低而NO水平则明显升高(P<0.05)。3.通过生理记录仪检测到,DM组大鼠的血压较对照组相比有明显升高(P<0.05);赤芍苷+DM组大鼠血压较DM组明显降低(P<0.05)。4.与对照组比较,DM组大鼠心体比明显升高(P<0.05);与DM组比较,赤芍苷+DM组大鼠心体比明显降低(P<0.05)。5.HE染色结果显示,DM大鼠的心肌肥厚,受损严重,心肌间隙变大,心肌细胞排列紊乱,经过赤芍苷+DM组干预后,心肌间隙明显变小,细胞排列也趋于规律,心肌肥厚情况明显减轻;DM组大鼠胸主动脉变形严重,薄厚不一,且已看不到完整的内皮层,纤维层弹性消失,并且细胞核排列紊乱,纤维层内出现空泡,而赤芍苷+DM组大鼠主动脉内皮层有很大程度的恢复,血管内层呈现完整内皮。甲苯胺蓝染色结果显示,对照组的左心室肌血管周围及胸主动脉周围偶有肥大细胞(mast cells,MC)的出现,但DM组的左心室血管及主动脉周围却聚集了大量的MC,很多已出现脱颗粒状态,而赤芍苷+DM组大鼠心肌血管及主动脉周围的MC已明显减少,效果明显。6.利用副交感神经递质ACh(0.3μM)处理大鼠心房后观察心房内压变化。结果显示,对照组的心房内压变化百分比为-39.15±6.82%,而DM组的心房内压变化百分比为-3.41±1.09%,两者之间有显著性差异(P<0.01)。赤芍苷(200mg/kg)+DM组心房内压变化百分比为-51.72±2.62%,与DM组比较,两者之间有显著性差异(P<0.01)。二甲双胍(200mg/kg)+DM组大鼠心房内压变化百分比为-19.46±4.2%,与DM组比较,两者之间有显著性差异(P<0.05)。7.利用副交感神经递质ACh(0.3μM)处理大鼠心房后观测ANP分泌变化。结果显示,对照组大鼠的ANP分泌变化百分比为43.25±8.95%,而DM组大鼠ANP分泌变化百分比为13.47±4.22%,两者之间有显著性差异(P<0.01)。赤芍苷(200mg/kg)+DM组大鼠的ANP分泌变化百分比为40.12±6.75%,与DM组比较,两者之间有显著性差异(P<0.01)。二甲双胍(200mg/kg)+DM组大鼠的ANP分泌变化百分比为20.43±6.33%,与DM组比较,两者之间有显著性差异(P<0.05)。8.赤芍苷明显促进HUVECs的存活率(P<0.01),而33 mM高糖明显抑制HUVECs的存活率(P<0.01)。赤芍苷能逆转33 mM高糖诱导的HUVECs的存活率的抑制效应效应(P<0.01)。9.与对照组比较,DM组大鼠胸主动脉中ACh的舒血管作用明显减弱(P<0.01),而分别用赤芍苷和二甲双胍干预DM大鼠后则均改善此减弱效应(P<0.01)。结论1.赤芍苷能显著降低DM大鼠的血压和血脂水平,并抑制其心脏和血管中的MC浸润而发挥抗炎作用。2.DM大鼠心房中ACh促进心房钠尿肽分泌的作用明显减弱,而赤芍苷则改善此减弱效应。3.DM大鼠胸主动脉中ACh的舒血管作用明显减弱,而赤芍苷则改善此减弱效应。