研究背景和目的一.非小细胞肺癌的治疗耐受肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的癌症之一。非小细胞肺癌(NSCLC)是一些不同起源的,具有高度异质性的肿瘤的总称,占据新诊断肺癌病例的85%以上(1)。目前已经有多种方法应用于NSCLC是二-二氨合铂(II)(通常被称为顺铂)。顺铂被用于治疗多种恶性实体肿瘤,包括睾丸癌、卵巢癌、头颈部肿瘤、结肠直肠癌、膀胱癌和肺癌(2)。顺铂对于肿瘤细胞杀伤的作用机制多样,但其最主要的作用模式为诱导产生DNA损伤,随后激活DNA损伤反应和诱导线粒体凋亡。相对于正常细胞,这些DNA损伤更容易在快速增殖的肿瘤细胞中产生,因此利用顺铂治的治疗,其中的一类重要的治疗方法是凋亡诱导化疗剂如,特别疗多种肿瘤,包括NSCLC,在临床上取得了一定的效果,有效延长了NSCLC病人的生存期(3)。然而,尽管接受顺铂治疗的病人往往拥有较好的初始反应,该治疗常常导致肿瘤产生化疗耐药性而导致治疗失败(3)。对于顺铂抗性的研究是目前针对NSCLC药物开发和靶向治疗的研究重点,这些研究发现了顺铂抗性涉及到多个方面,其基本被分为四大类(4,5)。第一类涉及在肿瘤细胞中DNA损伤/修复蛋白的异常活跃;第二类为肿瘤对药物的吸收产生拮抗;第三类机制可能使得药物在被吸收后失活或防止药物到达DNA靶标;第四类机制通过不同途径的生长信号传导或抗细胞凋亡蛋白的增加。值得注意的是,顺铂抗性极大可能具有多种机制,并且抗性的机制可以根据细胞类型而不同。因而无论抗性机制如何被阐释,以顺铂为主,结合其它治疗而提高肿瘤对于顺铂的易感性成为了当前的主要目标和策略。最近的先进化疗策略包括多种药物的联合治疗和分子水平的组织学/遗传检查,旨在针对不同的病人群体采取适当的策略来最大化顺铂的作用(6-8)。然而在一些临床实验中,联合治疗依然未能控制早期(3-5周)的复发(3)。因此,研究对于顺铂耐受的NSCLC细胞亚群起作用的治疗将是十分必要的,其有助于我们了解并逆转这些细胞的抗性从而达到对于NSCLC的全面治疗的目的。二.端粒结合蛋白的端粒外功能过去二十年的研究表明端粒功能障碍对于肿瘤的发生发展是至关重要的(9,10)。端粒功能障碍包括端粒序列的丢失、端粒结构的异常和端粒酶异常调控,其在组织老化和组织再生中的作用是当前研究的重点。然而另一方面,一些在之前研究中被证明为端粒结合蛋白的因子,被发现在远离端粒的不同位置仍具有结合位点。更重要的是,这些因子的部分功能是不依赖于端粒而存在的(11)。端粒结合蛋白的端粒外功能被发现与多种分子生物学现象相关,如线粒体功能、炎症、胚胎发育、基因表达调控、代谢、干细胞内环境稳定、细胞粘附和癌症(12,13)。当前的研究热点着重于研究端粒酶和端粒结合蛋白复合物shelterin的端粒外功能和介导这些功能的其他因子(14)。更进一步地,这些研究致力于在一个更全面的角度了解这些因子的生物学功能调控这些功能的详细机制。这些研究将增强我们对于维持端粒结构与其他分子生物学过程间联系的了解,但也提供有价值的信息并有助于解释人类遗传疾病、老化和癌症的发病机制,从而对人类健康和疾病治疗做出贡献。其中一个重要的例子是对于哺乳动物RAP1基因(抑制/激活蛋白-1,repressor/activator protein-1;或被称为TRF2IP,端粒重复序列结合因子-2互作蛋白-1,telomeric repeat binding factor-2 interacting protein-1)(15)。哺乳动物的RAP1基因与出芽酵母Rap1具有同源性,而在酵母中的研究发现,Rap1是酵母端粒的主要结合蛋白,且发挥控制端粒结构的重要作用,集中表现在它保护端粒、招募相关因子和端粒酶来控制端粒长度的功能(16-18)。此外,除了在端粒,酵母Rap1也发挥了转录因子的的作用,并通过控制糖酵解酶和核糖体相关基因的表达来控制酵母细胞的存活与增殖(19)。另一方面,对Rap1自身与端粒的结合并非十分透彻,一种理论认为其直接结合端粒DNA,而另一种理论认为RAP1被认为是由TRF2募集到端粒(20,21)。最近研究也正在尝试阐明Rap1基因在小鼠发育中的作用。目前,已有两个不同的Rap1敲除小鼠模型通过Cre同源重组系统成功地敲除了Rap1的外显子2和外显子3,另一种小鼠模型在Rap1外显子1和外显子2之间产生插入失活(22,23)。然而,其中的一项研究报告了RAP1敲除导致胚胎发育在第6.5天至第45天期间的死亡(23);而在另一种情况下,Rap1的敲除则被发现它不影响小鼠的生存与生育(22)。通过组织特异性敲除的小鼠模型,一些研究发现Rap1在上皮细胞中的缺失并非致命,但是导致皮肤色素沉着过早的早期发病以及部分衰老和肥胖的表型,尤其是在雌性动物中(22)。这些看似矛盾的结果说明了阐明RAP1在哺乳动物,尤其是人类疾病中功能的重要性。三.哺乳动物RAP1基因的端粒外功能研究虽然对于RAP1的转基因小鼠研究的成果有所争议,在哺乳动物细胞以及组织中的研究则揭示了RAP1重要的独立与端粒而存在的功能。通过使用染色质免疫沉淀结合测序(ChIP-seq)技术,Martinez等在其中一项研究中发现了Rap1的端粒外结合位点,并进一步发现了这些位点共享有(TTAGGG)串联的序列(11)。这些端粒外Rap1结合位点在亚端粒区域富集,而由这些区域的DNA序列所编码的基因在具有Rap1缺陷的细胞中均有不同程度的下调(11)。与之类似的是,RAP1作为非端粒依赖性转录因子的作用能够被一些特殊的增强子序列所放大。此外,Rap1亦在非基因编码区的染色体上具有结合,同样地,这些结合位点具有TTAGGG串联重复的共同点(24)。Rap1的结合在这些区域的作用可能包括稳定基因组和降低在这些区域重组的产生(24)。生物化学研究显示相比于酵母的Rap1蛋白,哺乳动物的Rap1已经失去了部分DNA结合结构域,这一现象也许有助于解释Rap1对于哺乳动物细胞的端粒保护作用并非不可或缺(20)。然而同时,Rap1也被发现可以与除TRF2以外的因子相互作用以帮助基因转录调节(15)。基因分析显示,在小鼠胚胎纤维细胞中,Rap1敲除后下调的基因涉及到多个信号通路,包括促进细胞增殖的信号、细胞粘附分子、代谢相关酶、胰岛素合成相关基因、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)信号传导分子和生长激素效应分子等(17)。另一方面,Rap1敲除后的细胞中ABC转运蛋白和涉及2型糖尿病的基因产生了显著上调(17)。因此,Rap1的缺失能够影响到多种生物学过程。而人类RAP1在端粒之外的另一个作用则是由其在细胞质中的表达而介导的(25)。通过全基因组功能筛选,人们发现RAP1被发现在细胞核调节因子-κB(NF-κB)信号通路中扮演重要作用。在多种人类细胞中发现,过表达的RAP1能够诱导NF-κB信号,而RAP1缺陷则会抑制NF-κB活性。在这些细胞中,RAP1的表达不仅位于端粒,甚至不局限于细胞核;一部分RAP1分子被发现位于细胞质中,成为一些大分子复合物的组成成分。免疫共沉淀的结果显示,RAP1与抑制性NF-κB激酶(IKK)复合物(IKKA-IKKB-IKKG)具有直接结合,而这种结合这对于NF-κB中p65亚基的磷酸化是必需的。NF-κB的亚基和IKKB抑制剂,使NF-κB以招募必要的染色质重塑蛋白用于靶基因的转录激活。RAP1与IKK复合物的结合起到了稳定该复合物的作用,从而使其能够介导p65的磷酸化和核转位,这一过程使得NF-κB下游基因的转录被激活。这一发现对于RAP1在转录调节中的作用提供了另一个角度的解释。有趣的是,这两者之间互为正反馈调节的关系:在RAP1激活NF-κB信号通路的同时,RAP1的表达水平也受到NF-κB信号传导调节。目前,在RAP1基因的启动子区域已发现两个NF-κB结合位点。因此,在细胞质中表达的RAP1是一个NF-κB信号通路重要的激活分子。虽然除去TRF2以外,并没有新的分子被发现能够和RAP1结合并介导其端粒外功能,RAP1的功能已被确定是可以独立于端粒而存在的。更重要的是,RAP1在细胞核和细胞质中的不同表达为其通过不同机制而影响细胞学过程提供了可能,同时这样的分布也使得RAP1可受到多重调控(16,26)。如RAP1募集到端粒是TRF2依赖的,而与端粒结合的TRF2的数量可以依细胞类型、分化程度、胚胎发育和年龄的不同而不同(23)。未与端粒结合的RAP1可能是一种调节转录网络的方式控制几种生物过程,如炎症反应和代谢(17)。作为控制细胞衰老的重要机制,RAP1水平(端粒结合与非端粒结合)可能随着衰老而降低,从而影响基因表达的变化,从而产生衰老相关的表型。特别地,NF-κB途径的失调已经与人类疾病,尤其是癌症相关(27)。NF-κB信号的持续激活已被证明有助于肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的发生与发展。由于RAP1对于该信号通路的激活作用,其端粒外功能势必对于肿瘤发生起到一定作用。在这方面,Teo等发现相较于邻近正常细胞,肿瘤细胞中的RAP1水平显着升高;同时,RAP1的表达水平肿瘤的恶性级别之间的正相关性也在乳腺癌中被发现(25)。这些肿瘤中p65的激活状况以及该激活对于RAP1的依赖性仍有待解决。四.问题的提出上述研究成果集中体现了RAP1在端粒外行使重要功能,对于不同信号通路能够进行转录和蛋白水平的调节。特别地,RAP1是一个必要以及重要的NF-κB信号正调控因子,而该信号通路在肺癌的发生发展中起到核心作用。持续活化的NF-κB信号促进NSCLC细胞增殖,更重要的是介导其耐药性。尤其是对于顺铂的耐药,其已在多种肿瘤中被证明与NF-κB的激活相关。然而,RAP1基因本身在NSCLC中的功能研究依然十分缺乏。基于此,我们开展了对于RAP1介导NSCLC细胞生长、凋亡和顺铂抗性的研究(详见研究结果部分)。在此项研究中我们发现:(A)细胞质中的RAP1在NSCLC组织中的表达与肿瘤恶性程度呈一定正相关性;(B)细胞质RAP1在NSCLC细胞中过表达;(C)RAP1在NSCLC细胞中具有促进细胞增殖与顺铂耐药的作用,而这一作用是通过上调NF-κB依赖性的抗凋亡蛋白BCL-2来完成的;(D)具有RAP1缺陷的NSCLC细胞对于顺铂的易感性增强;(E)RAP1对于顺铂耐药NSCLC细胞的存活是必需的。我们的研究结果表明RAP1的肿瘤进展的端粒外功能,并建议RAP1可以成为顺铂耐药NSCLC的治疗靶点。研究结果简述一.细胞质RAP1与NSCLC恶性程度之间的关系根据参考文献中的报道,在乳腺癌组织中曾检测到细胞质RAP1,并且其在病理切片中的表达量与肿瘤级别呈正相关(25)。因此我们提出了细胞质RAP1是高级别NSCLC的生物标志物的假说。为了验证这一假说,我们利用免疫组化在93个肺腺癌和75个肺鳞状细胞癌组织中测定了RAP1的细胞质和核表达量。瘤旁正常组织用于反映非恶性细胞中的RAP1表达。我们发现,与正常组织相比,NSCLC肿瘤细胞质和核RAP1均增加,但细胞质RAP1的差异似乎更大。同时,细胞质RAP1高表达(n=33,表达量>0.4)和RAP1低表达(n=59,表达量<0.4)腺癌患者之间的存活率进行Kaplan-Meier生存曲线分析后,我们得出了较高的细胞质RAP1表达与腺癌患者预后较差有关这一结论。这些结果为细胞质RAP1成为高级别NSCLC的诊断指标提供了可能性,同时表明细胞质RAP1可能在癌症进展中起关键作用。二.RAP1与NSCLC细胞生长之间的关系利用肺癌细胞实验,我们比较了三种NSCLC细胞系和两种肺上皮细胞系之间RAP1的表达,包括腺癌细胞A549和PC9,以及鳞癌细胞HCC827,而正常细胞包括支气管上皮细胞16HBE和小气道上皮细胞HSAEC1-KT。在NSCLC细胞中,与正常肺上皮细胞相比,我们检测到RAP1具有整体较高的mRNA和蛋白表达,而这样的高表达在细胞质中更加明显。由于目前尚无特异性抑制细胞质RAP1的技术,我们使用shRNA进行RAP1敲低来研究其对于肺癌细胞生长的作用。RAP1敲低后的三株NSCLC细胞在培养过程中均表现出生长速度的减慢。这一结论在测定细胞数量与克隆形成率的实验中均得到证实。这些结果表明RAP1是A549细胞生长所必需的。三.RAP1在NSCLC细胞中介导NF-κB信号通路的激活由于RAP1本身不足以形势保护端粒的作用(22),细胞核中的RAP1在维持过度增殖的肿瘤细胞中的基因组稳定性方面的作用也是有限的。因此,我们推测细胞质RAP1是诱导细胞增殖的主要原因。以前的研究证明,细胞质RAP1可以介导NF-κB信号通路中的重要因子p65的磷酸化(25)。而在A549细胞中RAP1被敲低时,我们也观察到细胞核中磷酸化的p65的减少。促进NF-κB信号传导的磷酸化IκBα也随着RAP1的缺失而降低。活化的NF-κB能够促进IL-1,MCP-1和CD44基因的转录,而RAP1的敲低导致这些基因表达的下调。这些结果表明NSCLC细胞的增殖由RAP1介导的NF-κB活化来进行正向调节。四.RAP1介导NSCLC细胞中的顺铂抗性活化的NF-κB已被证明能够诱导癌细胞产生对化疗药物的抗性(27,28)。尤其是在NSCLC中,CD44这一NF-κB通路的下游靶基因恰好是顺铂(Cisplatin,CP)抗性细胞亚群的表面标志物之一(29)。因此,我们猜想RAP1介导了NSCLC细胞对CP的抗性。为了验证这一猜测,我们首先用不同浓度的CP处理RAP1 shRNA或scramble shRNA(对照组)转导的A549细胞48小时。相对高剂量的CP(>2μM)清除了两组中几乎所有的细胞。然而,当使用较低浓度的CP时,相较于对照组,RAP1缺失的细胞数量明显减少。接下来,我们研究过表达的RAP1对CP抗性的影响。评估了用对照组或RAP1过表达慢病毒载体转导后A549细胞的增殖。出乎意料的是,当A549细胞过表达RAP1后,它们的生长速度增加并不明显;然而,它们对于CP的抗性则显著增加了。为了进一步了解RAP1介导的CP抗性,我们进行了“竞争性增殖”的实验,将正常的A549细胞(GFP-)与RAP1过表达或敲低的细胞(GFP+)以1:1的比例混合,并用2μM的CP处理24h或72h。与正常细胞相比,在这样的CP浓度条件下,RAP1过表达的细胞明显具有增殖优势而RAP1敲低后的细胞生长受到显著的抑制,表明了RAP1能够介导对于CP的抗性。CP的作用是通过在增殖性癌细胞中产生DNA损伤,而最终导致其凋亡。然而,RAP1本身似乎对CP诱导的DNA损伤似乎没有显着影响。因此,我们怀疑RAP1的功能在于控制产生DNA损伤的细胞使其免于凋亡。为了验证这一假设,我们将未用慢病毒处理的(UnTx D)A549细胞和具有RAP1过表达(RAP1)或RAP1敲低(shRAP1)的A549细胞在含有1μM CP(+)或无CP培养基(-)中培养24h,并分析cleaved caspase-3(C-Cas3)和BCL-2,以及利用Annexin-V的流式细胞术分析细胞凋亡的情况。在具有过表达的RAP1的细胞中,CP没有引发cleaved caspase-3的明显上调;相比之下,在RAP1敲低的细胞中,短时间的CP处理即诱导细胞产生了大量的cleaved caspase-3。类似地,在RAP1过表达细胞中,CP处理后Annexin-V+凋亡细胞的比例降低;反之,RAP1缺失的细胞中,该比例增加。当检测抗凋亡因子BCL-2时,我们发现RAP1和BCL-2表达之间呈正相关,且这一现象在未经CP处理时就已发现。利用CP处理后,在对照组和RAP1过表达的细胞中BCL-2表达量略有上升,其中的原因可能是CP诱导凋亡后的负反馈调节机制。然而,当利用CP处理RAP1敲低的细胞后,在依然存活的细胞中BCL-2几乎没有增加,表明RAP1对于BCL-2的上调具有必要性。因此,我们可以得出结论,RAP1抑制CP诱导的细胞凋亡,从而促进细胞产生CP抗性。五.顺铂抗药性与RAP1依赖性的NF-κB活化为了进一步研究RAP1表达与CP抗性之间的相关性,我们用持续增加剂量的CP来处理A549细胞以产生具有不同程度的耐药性的细胞,并在多个时间点对于存活下来的细胞取样以研究RAP1表达。我们首先发现,这样的CP处理导致细胞质而非细胞核中RAP1的增加。同时增加的还有NF-κB活性相关的因子,如pp65和p-IκBα的变化所示。值得注意的是,相较于RAP1表达量的变化,pp65和p-IκBα的增加表现出一定的延迟,说明这些因子很可能位于RAP1的下游。用RT-PCR分析NF-κB信号转导靶基因的mRNA表达能够看出,在持续的CP过程中,IL-1,MCP-1和CD44的转录也被促进,这进一步证明了NF-κB信号通路的激活。为了阐明RAP1在CP激活NF-κB信号通路这一过程中的作用,我们利用与前述类似的递增浓度的CP对RAP1过表达和RAP1敲低的细胞进行处理。我们发现RAP1过表达细胞中基础NF-κB活性与对照组相比明显上升,并在CP处理后进一步加强。然而,在持续的CP处理后,RAP1过表达细胞与对皂秀之间的NF-κB活性没有显着差异,这可能是由于持续的CP处理使得NF-κB活性达到了饱和状态。此外,当相同的CP递增浓度的处理作用于RAP1敲低的细胞中时,我们发现0.5μM的CP即对RAP1敲低的细胞具有相当大的毒性,而1μM的CP几乎消除了所有的细胞。这两种浓度对于对照组则并无明显的毒性。更重要的是,当使用0.1μM和0.5μM的CP去处理RAP1敲低的细胞后,虽然仍有部分细胞存活,但在存活的细胞中,NF-κB的活性并没有上升。因此,RAP1可被看做是CP诱导NF-κB活化的重要中间介质,或者说RAP1对于在CP治疗中存活(具有CP抗性)的细胞中NF-κB的活化是必要的。并且,鉴于以往研究发现NF-κB能够直接调节BCL-2基因的转录(30),我们得出的结论是RAP1-NFκB-BCL2调节通路在肺癌细胞中能够介导CP抗性。六.RAP1对于顺铂耐药NSCLC细胞存活的必要性上述研究证明了RAP1具有抑制CP诱导的细胞凋亡的作用,并且抑制RAP1的表达能够增强NSCLC细胞对于CP的易感性。于是我们从相反的角度进行设想:当细胞已经具有了CP抗性,RAP1的缺失会对其有何影响?为解答这一问题,我们首先使用在先前的研究中所描述的方案(31,32)获得了具有CP抗性的A549细胞(A549R)。首先注意到的是,A549R细胞相较于正常的A549细胞,具有更高的细胞质RAP1表达量与NF-κB活性。同时与正常A549细胞相比,A549R细胞中BCL-2的表达要高得多,不过这可能是由于这些细胞必须使用含有CP的培养基来维持其抗性。由于前述研究已阐明RAP1能够介导CP抗性,我们首先试图通过敲低RAP1来减弱A549R细胞中的CP抗性。然而意想不到的是,sh-RAP1处理后的A549R细胞几乎无法存活。这一现象不仅可以通过CCK-8细胞存活率检测来说明,甚至可以在显微镜下清楚地发现。由于A549R的CP抗性需要使用含有CP的培养基来维持,我们仍需要排除这些CP使得细胞死亡的可能性。因此,在敲低RAP1之前,我们将A549R细胞培养在无CP培养基中培养24小时。这种“CP清除”的过程并不影响细胞的CP抗性,但是经过处理后的细胞在RAP1敲低之后仍然不能存活超过7天。将RAP1缺失的A549细胞和加扰shRNA转导的A549R细胞在含有1μMCP(+)或无CP培养基(-)的培养基中培养24小时,然后裂解收获蛋白质。通过对于这些细胞的进一步分析,我们发现在RAP1敲低后的A549R细胞中,cleaved caspase-3出现明显上调,而BCL-2几乎完全消失,即使这些细胞在RAP1敲低前已经经过“CP清除”的过程。Cleaved caspase-3上调的程度与RAP1敲低的A549细胞经CP处理后的情况相似。与此相一致的是通过Annexin-V染色后所发现的,在RAP1敲低的A549R细胞中显著增加的细胞凋亡比例。因此,在A549R细胞中,RAP1表达量的下降足以通过细胞凋亡的高度激活而清除细胞,这一过程甚至不需要进一步的CP处理。结论顺铂(CP)是一种常见的抗癌药物,通过诱导产生DNA损伤来导致细胞凋亡。在NSCLC细胞中,CP的抗性与细胞质中的RAP1密切相关。细胞质中的RAP1在CP处理后上调,进而介导NF-κB信号的激活;激活的NF-κB调控下游靶基因转录,其中包括重要的凋亡抑制因子BCL-2。RAP1的激活则很有可能是细胞中DNA损伤反应的一部分。因此,RAP1通过激活NF-κB信号传导来诱导抗凋亡蛋白BCL-2的上调,从而在不明显改变DNA损伤情况的状态下抑制细胞凋亡,来实现CP的抗性。这些发现表明细胞质RAP1可能在顺铂耐药性癌症治疗中具有重要的临床意义。首先,RAP1可以作为NSCLC不良预后相关的重要标记;其次,RAP1可用于鉴定NSCLC病例是否适用于CP的治疗;最后,针对RAP1的靶向治疗是一种与CP进行联合治疗的可行性方案。