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目的通过细胞内外实验观察P21活化的蛋白激酶2(PAK2)磷酸化原癌基因蛋白c-Jun对细胞增殖和转化的影响,阐明PAK2在肿瘤发生发展中的作用,探讨PAK2作为肿瘤治疗新靶点的可能性,为恶性肿瘤治疗提供新的思路和方法。方法1.利用Western blotting技术检测细胞内蛋白表达水平。2.利用sh-RNA技术使小鼠上皮JB6 C141细胞内以及人黑色素瘤SK-MEL-5细胞内PAK2表达下降(knockdown),观察其对细胞增殖,转化和AP-1活性的影响。3.细胞增殖实验观察不同处理因素条件下对细胞增值的影响。4. Soft-agar克隆实验(anchorage-independent cell transformation assay)分析小鼠上皮JB6 C141细胞内,人黑色素瘤SK-MEL-5细胞内PAK2表达下降(knockdown)对细胞转化的影响；小鼠上皮JB6 C141细胞内稳定的转染五个苏,氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时被突变的c-Jun质粒(pcDNA4-mut-c-Jun)对细胞转化的影响。5.转录因子AP-1活性检测实验。应用AP-1活性检测方法观察小鼠上皮JB6 C141细胞内,人黑色素瘤SK-MEL-5细胞内PAK2表达下降对转录因子AP-1活性的影响；JB6细胞内稳定转染五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时被突变的c-Jun质粒(pcDNA4-mut-c-Jun)对转录因子AP-1活性的影响；JB6细胞内瞬时转染pcDNA3.1-PAK2和野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun), pcDNA3.1-PAK2和五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时被突变的c-Jun质粒(pcDNA4-mut-c-Jun)对转录因子AP-1活性的影响。6.应用哺乳动物双杂交实验(Mammalian two-hybrid assay)观察PAK2和c-Jun是否能在细胞内结合。7.体外PAK2激酶活性检测实验(PAK2 kinase assay)观察有活性的PAK2激酶是否能结合并磷酸化全长的c-Jun蛋白；观察有活性的PAK2激酶磷酸化全长的c-Jun蛋白是在丝氨酸位点还是苏氨酸位点。8.免疫共沉淀实验(Immunoprecipitation)观察外源性的PAK2和野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)是否能在细胞内结合。9. c-Jun肽段图分析(c-Jun piptides mapping)检测c-Jun蛋白能够被PAK2磷酸化的苏氨酸位点。结果1.利用Western blotting技术检测细胞内蛋白表达水平结果：①表皮生长因子EGF能活化PAK2,在EGF(10ng/ml)处理15分钟后后,能看到PAK2被活化,随着EGF刺激时间的延长,PAK2的磷酸化水平显示出逐渐增强的趋势,在EGF刺激3小时后PAK2出现最强的磷酸化活性。同时,由EGF诱导的ERK1／2的磷酸化作为一个阳性对照。②在稳定表达sh-mock和sh-PAK2的JB6细胞系中用EGF(10ng/ml)于不同时间点刺激条件下检测了一些蛋白表达水平。结果表明,与对照组sh-mock相比,在PAK2表达下降稳定细胞系中,所有被检测的蛋白表达水平(p-ERKl/2, ERK1/2, p-RSK,RSK, p-c-Jun(Ser63), p-c-Jun(Ser73), c-Jun, c-Fos)都没有改变。③在JB6细胞中转染野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)质粒和五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时被突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)质粒,建立稳定细胞系,在稳定表达野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)和五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6细胞中,我们检测到xpress标签以证实pcDNA4-wt-c-Jun和pcDNA4-mut-c-Jun已被成功的转染入JB6细胞。④在小鼠上皮JB6 C141细胞,人皮肤角质Hacat细胞,人黑色素瘤SK-MEL-5和SK-MEL-28细胞中检测了PAK2蛋白的表达水平,结果显示出PAK2在人黑色素瘤细胞SK-MEK-5和SK-MEK-28中是高表达的。2.利用sh-RNA技术使小鼠上皮JB6 C141细胞内以及黑色素瘤SK-MEL-5细胞内PAK2表达下降(knockdown)的结果。①在JB6细胞中感染sh-PAK2病毒载体建立稳定细胞系,阻滞了90%的内源性的PAK2蛋白的表达。②在人黑色素瘤SK-MEL-5细胞中感染sh-PAK2病毒载体建立稳定细胞系,阻滞了大约80%的内源性的PAK2蛋白的表达。3.细胞增殖实验结果。①比较稳定表达sh-mock和sh-PAK2的JB6细胞的增殖曲线,结果显示出稳定表达sh-PAK2的JB6细胞的增殖明显的低于稳定表达sh-mock的JB6细胞的增殖(P<0.05)。②比较稳定表达五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)和野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6细胞的增殖曲线,结果显示出稳定表达五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6细胞的增殖明显低于稳定表达野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6细胞的增殖(P<0.05)。③比较稳定表达sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5细胞的增殖曲线,结果显示出稳定表达sh-PAK2的人黑色素瘤细胞SK-MEL-5细胞的增殖明显的低于稳定表达sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5细胞的增殖(P<0.05)。4. Soft-agar克隆实验(anchorage-independent cell transformation assay)结果。①比较稳定表达sh-mock和sh-PAK2的JB6细胞在soft-agar中产生的克隆数,结果显示出稳定表达sh-PAK2的JB6细胞在soft-agar中产生的克隆数明显的少于稳定表达sh-mock的JB6细胞在soft-agar中产生的克隆数(P<0.05)。②比较稳定表达五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)和野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6细胞在Soft-agar中产生的克隆数,结果显示出稳定表达五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6细胞在Soft-agar中产生的克隆数明显的少于稳定表达野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6细胞在Soft-agar中产生的克隆数(P<0.05)。③比较稳定表达sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5细胞在Soft-agar中产生的克隆数,结果显示出稳定表达sh-PAK2的人黑色素瘤细胞SK-MEL-5细胞在Soft-agar中产生的克隆数明显的少于稳定表达sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5细胞在Soft-agar中产生的克隆数(P<0.05)。5.转录因子AP-1活性(AP-1 activity)检测实验。①比较稳定表达sh-mock和sh-PAK2的JB6细胞的AP-1活性,结果显示出稳定表达sh-PAK2的JB6细胞AP-1活性明显的低于稳定表达sh-mock的JB6细胞(P<0.05)。②比较稳定表达五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mu t-c-Jun)和野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6细胞的AP-1活性,结果显示出稳定表达五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6细胞AP-1活性明显的低于稳定表达野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6细胞(P<0.05)。③比较稳定表达sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5细胞的AP-1活性,结果显示出稳定表达sh-PAK2的人黑色素瘤细胞SK-MEL-5细胞AP-1活性明显的低于稳定表达sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5细胞(P<0.05)。④.当野生型c-Jun (pcDNA4-wt-c-Jun)和pcDNA3.1-PAK2质粒被共同瞬时转染入JB6细胞时,与其它转染组相比,AP-1的活性明显的升高(p<0.05)。然而,当五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变的c-Jun (pcDNA4-mut-c-Jun)和pcDNA3.1-PAK2质粒被共同瞬时转染入JB6细胞时,与pcDNA3.1-PAK2和pcDNA4-wt-c-Jun共转染组相比,AP-1的活性显著降低(p<0.05)。6.哺乳动物双杂交实验(Mammalian two-hybrid assay)结果显示PAK2和c-jun能够在HEK293细胞中结合,当pBIND-PAK2和pACT-c-Jun共转染时,其luciferase的活性大约是对照组(只转染pG51u)的35倍高；pBIND-PAK2和pACT-c-Jun共转染组作为阳性对照,其luciferase的活性大约是对照组(只转染pG51u)的65倍高。7.体外激酶活性检测(PAK2 kinase assay)实验结果显示：①.PAK2能够在细胞外结合并磷酸化c-Jun.②.PAK2能够在苏氨酸位点强烈的磷酸化c-Jun,而不能在丝氨酸位点磷酸化c-Jun,包括两个著名的位点丝氨酸63(Ser63)和丝氨酸73(Ser73)。8.免疫共沉淀实验(Immunoprecipitation)结果显示：外源性的PAK2和野生型c-Jun转入细胞后,V5标签的PAK2被V5抗体结合并被beads共沉淀,c-Jun蛋白能够随着PAK2的沉淀被免疫共沉淀,这说明PAK2和c-Jun在细胞内能够结合。9. c-Jun肽段图(c-Jun piptides mapping)分析检测结果：①.T2,T8,T89,T93,T286五个位点信号较强,T91,T126,T231三个位点没有信号,表明PAK2磷酸化c-jun在五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)。②.有活性的PAK2激酶与不同位点突变的全长的c-Jun蛋白在细胞外反应显示,只有五个位点同时突变(T2,T8,T89,T93,T286),PAK2才不能磷酸化c-Jun。结论1.在小鼠上皮JB6 C141细胞中及人黑色素瘤SK-MEL-5细胞中感染(infect) sh-PAK2病毒载体,建立稳定细胞系,使PAK2表达下降,阻滞细胞生长和转化,同时AP-1活性下降。2.c-Jun的五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)同时突变后,阻滞细胞生长和转化,同时AP-1活性下降。3.PAK2能结合并磷酸化c-Jun在五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)而影响AP-1的活性,进而促进细胞的增殖和转化。4.PAK2调节AP-1活性不是通过磷酸化c-Jun的丝氨酸63(Ser63)和丝氨酸73(Ser73)实现的,而是通过磷酸化c-Jun的五个苏氨酸位点(T2,T8,T89,T93,T286)实现的。5.PAK2可能成为临床上治疗恶性肿瘤的一个新靶点。