生物在数十亿年的进化过程中获得了多种多样的生存技能,动物泌丝算是其中一种。对于泌丝动物来丝说,丝纤维对其生存和繁衍具有至关重要的作用。家蚕（鳞翅目昆虫）是一种泌丝动物,由于蚕丝具有性能优异和环保无毒等优点而被广泛应用于纺织、医疗、健康食品和先进材料等领域。蚕丝属于一种天然动物丝纤维,动物丝通常被认为是微小晶区分散在连续无定型区中而形成的半结晶纤维材料,其中晶区主要由反向平行排列β-折叠结构构成,无定型区主要由无规线团/螺旋结构构成,这种晶区和无定型区再组装形成的具有一定取向性的聚集态结构赋予了蚕丝优异的力学性能。蚕丝的半结晶结构在赋予其力学性能时有明确分工,结晶区决定了蚕丝的强度和弹性模量,晶体总量、颗粒大小、取向性以及完整度等都会影响蚕丝的强度和模量性能;非结晶区主要决定蚕丝的延展性。两者共同决定了蚕丝韧度,韧度是评价蚕丝性能的一个综合指标。基于目前对蚕丝结构、性能以及二者之间关系的认识,许多科学家致力于改造蚕丝的力学性能以拓展蚕丝的应用领域。目前改性蚕丝的方法包括:物理改性、化学改性、添食特殊物质改性、开发再生丝素蛋白纤维以及转基因技术改性等。但是成功提高蚕丝力学性能的研究却非常少见,主要是因为我们对蚕丝结构性能之间的关系的认识还不够深入,我们现在掌握的知识还不足以精确指导我们定向改造蚕丝。虽然科学家们已经通过核磁共振、红外光谱、拉曼光谱、广角X-射线衍射和小角X-射线散射等技术从微观角度解析蚕丝的多层级结构,但是,蚕丝中二级结构如何组装成更高级的聚集态结构、不同层次的结构如何协同作用赋予蚕丝优异的综合力学性能以及不同类型蚕丝的力学性能差异性的原因仍然模糊不清,仍然有很多未知信息等待着研究者的探索。基于上面的分析,我们探究了弯曲对新生蚕丝结构和性能的影响、分析了不同龄期蚕丝在结构和性能方面的差异,获得了关于结构性能方面的新规律,并利用新规律去指导我们使用转基因技术改造蚕丝的力学性能。主要研究结果如下:1.弯曲处理对新生蚕丝结构性能的影响我们首先设计了一个非常精密的可调速步进电机系统用于强拉丝。对不同角度弯曲处理蚕丝的表面和横截面形态的观察结果显示:蚕丝仍然是由两股组成,弯曲处理不改变蚕丝的股数;随着弯曲处理角度增加,蚕丝长轴直径越来越小,横截面也越来越小,即蚕丝越来越细。力学性能检测结果显示:随着弯曲角度增加,蚕丝的伸长率逐渐减小,弹性模量、强度和韧度都出现了先增大后减小的变化趋势,并且在67.5°到90°的弯曲范围内,蚕丝的弹性模量、强度和韧度会最好。我们利用同步辐射傅里叶变换红外光谱技术（FTIR）对各角度弯曲处理蚕丝进行了二级结构分析。结果显示:随着弯曲角度增加,蚕丝的β-折叠结构含量逐渐增加。这说明强拉丝弯曲处理过程中,角度增大会使蚕丝与转子之间的相互作用力增大,进而会促进更多β-折叠结构的形成。我们利用同步辐射广角X-射线衍射技术对各角度弯曲处理蚕丝进行了晶体结构分析,首先我们计算了各角度弯曲处理蚕丝的结晶度,结果显示:随着弯曲角度增加,蚕丝结晶度逐渐增加,这个结果同FTIR结果一致,因为晶体结构主要由β-折叠组成。接着我们利用Herman取向因子法对各角度弯曲处理蚕丝进行了取向分析,结果显示:随着弯曲角度增加,蚕丝取向因子逐渐降低。最后,我们利用谢乐公式法计算了各角度弯曲处理蚕丝的晶粒尺寸,结果显示随着弯曲角度增加,蚕丝晶体颗粒逐渐增大,这个结果同FTIR结果和结晶度结果一致。弯曲对新生蚕丝力学性能的影响可以总结为:随着弯曲角度的增加,蚕丝结晶度和晶粒尺寸逐渐增大,而取向因子逐渐降低。前期是由结晶度增加引起力学性能提高占据主要作用,后期是由取向因子降低和晶粒尺寸增大造成力学性能下降占据主要作用,所以经过不同角度弯曲处理的蚕丝的综合力学性能出现先增大,后减小的变化趋势。而67.5°到90°的弯曲角度范围是分界线,弯曲角度处于这个区域时,蚕丝表现出最佳的力学性能。接着我们利用三维空间坐标系和空间向量夹角公式建立了蚕丝（吐丝时）自然弯曲角度的分析方法,调查结果显示:蚕丝自然弯曲角度范围为70.23°–87.98°。这个结果刚好处于力学性能最好的弯曲角度范围内。家蚕吐丝时蚕丝的自然弯曲角度与力学性能最佳的弯曲角度范围恰好重合,我们分析认为这是进化选择的结果:由于丝蛋白的特性决定蚕丝纤维最后需要经过大约67.5°–90°范围的弯曲处理其性能才能达到最佳状态,为了获得性能最好的丝去营建保护性最好的茧,蚕的吐丝行为逐渐进化成现在的方式,这或许也是家蚕吐丝时头部呈8字型摆动的原因之一。当然还有另一种可能,由于自身的生理结构特点决定家蚕只能以8字型路径吐丝,而且新生蚕丝必然会发生大约70.23°–87.93°范围的弯曲,为了避免弯曲对蚕丝力学性能和蚕茧保护性能的影响,蚕通过进化选择了一个经过70.23°–87.93°范围的弯曲处理后其力学性能达到最佳的丝蛋白;利用该丝蛋白形成的蚕丝和蚕茧的力学性能最好,最有利于保护蛹,也最有利于蚕的生存和繁衍。2.不同龄期蚕丝结构性能首先我们分别收集了来自家蚕不同发育阶段（一个蚕生命周期）的10种蚕丝:1龄起丝（I-B silk）、1龄末丝（I-E silk）、2龄起丝（II-B silk）、2龄末丝（II-E silk）、3龄起丝（III-B silk）、3龄末丝（III-E silk）、4龄起丝（IV-B silk）、4龄末丝（IV-E silk）、茧衣丝（Scaffold silk）和茧丝（Cocoon silk）。然后我们分别精确测量了10种蚕丝的力学性能,结果显示:10种蚕丝明显可以分为3大类:幼龄起丝、幼龄末丝和熟蚕丝（茧衣丝和茧丝）。幼龄丝力学性能优于熟蚕丝,幼龄末丝力学性能优于幼龄起丝和熟蚕丝,其中幼龄末丝具有超强的力学性能。从生物学功能上讲,幼龄丝力学性能优于熟蚕丝是必然的,因为在觅食、取食和移动过程中,为了抵抗恶劣的自然环境（主要是风吹以及其引起的震动）,幼蚕需要吐出力学性能非常优异的幼龄丝来保证自身不会从桑叶或桑树上掉下去。尤其是在幼龄末期,幼蚕还需要使用力学性能更加优异的幼龄末丝来固定身体和帮助自身蜕皮。因此幼龄丝对幼蚕的生长发育关重要,所以幼龄丝具有优异的力学性能。而对于熟蚕丝来说,数量众多的熟蚕丝聚集在一起,其综合力学性能已经足够保护蚕蛹,所以不需要单根熟蚕丝的力学性能也很优异。然后我们利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱技术对10种蚕丝的二级结构进行了表征,结果显示:幼龄末丝的β-折叠含量均高于熟蚕丝和幼龄起丝。这是幼龄末丝具有较高力学性能的原因。接着我们利用普通广角X-射线衍射（XRD）技术分析了10种蚕丝的结晶度,结果显示:随着龄期的增加,蚕丝的结晶度在逐渐减小,这是幼龄蚕丝龄期越小其伸长率越低的原因。IV-B silk的综合力学性能最好,但其结晶度并不是最高的,因此,结晶度与力学性能并不完全呈正相关关系,只有当β-折叠晶体结构、α-螺旋晶体结构、α-螺旋非晶态结构和无规卷曲结构达到某种平衡时,蚕丝才能获得最佳的力学性能。最后,我们还利用LC-MS/MS技术对比分析了高性能丝—IV-B silk和茧丝在主要丝蛋白含量上的差异。结果显示IV-B silk丝素中P25蛋白的含量增加了大约2.9倍,由于P25蛋白是一个具有分子伴侣功能的小分子蛋白,其本身对于丝素小体的组装和分泌起着重要作用。推测在IV-B silk中额外的P25蛋白具有促进Fib-H蛋白形成更多β-折叠结构、连接大分子和增强分子网络稳定性进而增强IV-B silk力学性能的作用。3.利用转基因技术创制高性能蚕丝材料我们分别选定黄粉虫抗冻蛋白TmAFP4-9、黑腹果蝇热激蛋白HSP（分子伴侣蛋白）和蜘蛛丝小分子富含半胱氨酸滑结蛋白CRP2作为目标蛋白,构建了3个融合重组蛋白转基因表达载体,并通过注射和阳性个体筛选,获得了名为AFP、HSP和CRP的转基因品系。插入位点分析结果显示目标基因AFP插入位点为家蚕基因组的7号染色体中scaffold 45的3412298–3412373位点,HSP插入位点为家蚕基因组的24号染色体中scaffold 43的6140556–7406261位点,CRP插入位点为家蚕基因组的11号染色体中scaffold 16的9968206–11378158位点。RT-PCR结果显示,3个目标蛋白基因成功在家蚕后部丝腺中表达。后部丝腺免疫荧光结果显示目标蛋白成功在家蚕后部丝腺表达并分泌到丝腺腔中。茧丝Western blot结果显示目标蛋白成功掺入蚕丝中。对转基因品系家蚕的丝腺和蚕茧的表型观察结果显示:3个融合重组蛋白对丝腺发育,蚕茧大小、茧形、颜色均没有明显影响。但AFP和HSP会使转基因蚕茧横切面出现疏松多孔现象,最后3个融合重组蛋白对茧层率和茧丝平均直径也没有明显影响。力学性能测试结果显示:AFP和HSP转基因蚕丝的力学性能得到全面性的提高,CRP蚕丝的力学性能提高不明显,蚕丝综合力学性能高低顺序依次为:AFP>HSP>CRP>D9L。3个转基因品系蚕丝的动态力学性能储能模量-温度曲线比较结果显示,转基因蚕丝无定型区分子紧密程度都低于对照D9L;由于HSP分子量最大,所以它的无定型区分子紧密程度最低。损耗因子-温度曲线图显示转基因蚕丝的T_β1和T_β2两个低温相变损耗峰向高温区域移动了,说明转基因蚕丝无定型区域结合水的能力得到增强;损耗因子-温度曲线图显示转基因蚕丝比D9L蚕丝多出一个T_βX的相变损耗峰,我们推测这是外源融合蛋白与丝蛋白之间相互作用引起的;另外,转基因蚕丝的主相变损耗峰T_g2（玻璃化转变温度）向高温区域偏移,这说明转基因蚕丝的无定型区整体分子链的活动性都受到重组融合蛋白的交联影响,分子链之间的相互作用得到加强。可以肯定,融合重组蛋白掺入到转基因蚕丝无定型区,影响蚕丝动态力学性能。同步辐射傅里叶变换红外光谱检测结果显示3个转基因品系蚕丝的β-折叠含量都得到提高,含量高低顺序依次为AFP>HSP>CRP>D9L,这与力学性能性能结果一致。同步辐射广角X-射线衍射测试结果显示:3个转基因品系蚕丝的结晶度都得到提高,含量高低顺序依次为AFP>HSP>CRP>D9L,这与FTIR结果和力学性能性能结果一致;3个转基因品系蚕丝的晶粒尺寸都变小,大小顺序依次为D9L>CRP>HSP>AFP;3个转基因品系蚕丝的取向因子都变小,大小顺序依次为D9L>CRP>HSP>AFP。AFP和HSP力学性能显著提高的原因要归结为:结晶度增加、晶粒细化、取向因子小幅减小、再加上融合重组蛋白的交联作用。