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UBK03来源于江西省“721铀矿”沙洲矿区,是一株氧化能力极强的化能自养细菌,其生长最适pH为1.3-1.5,最适温度为39-42℃,革兰氏染色反应阴性,菌体在幼龄期为弧形,老龄期为螺旋状,有鞭毛,好氧。根据其16S rDNA序列(GenBank登录号:DQ534052)分析,发现它属于钩端螺旋菌中的Group Ⅱ即嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)。 利用该菌在培养过程中亚铁离子的变化规律,分析了该菌对金属离子镍、钴、锌、铜和镉的抗性。结果发现该菌对金属离子镍的抗性最强。同时该菌对锌及钴离子也表现出较强的抗性,而对镉及铜离子的抗性较弱。 提取嗜铁钩端螺旋菌UBK03的基因组DNA,构建基因组文库,从中筛选出一段能产生镍抗性的DNA序列(GenBank登录号DQ517331)。该段序列共有3991bp,命名为nr21,利用计算机分析发现这段序列中可能编码四个和镍抗性有关的基因分别命名为ncrA,ncrB,ncrC及ncrY,同时还可能编码三个启动子,即p1,p2及p3。采用进化树分析发现该菌株编码的抗镍系统是一种由MFS蛋白家族介导的抗镍系统,而该菌是继Klebsiella oxytoca及Hafnia alvei 5-5之后发现的第三种含有该类抗镍系统的菌。 为了分析验证克隆序列中编码的四个基因的功能,分别制作了pNR21中四个基因(ncrA,ncrB,ncrC及ncrY)的插入突变(pNTA,pNTB,pNTC及pNTY)及删除突变(pNDA,pNDB,pNDC及pNDY)。然后分别分析了含有该突变质粒的菌株对镍的抗性,发现这四个基因的性质是不同的。其中ncrA,ncrB及ncrC为结构基因,这三个基因中任意一个突变都会抑制含有该突变体质粒菌株的抗镍能力。而基因ncrY的作用正好相反,它编码一个能对整个抗镍系统起到负作用的因子,该基因的突变会使含有该突变质粒的菌株的镍抗性能力提高。 通过测定比较同一种菌(含有质粒pNR21或pNCRABC)在经过镍诱导及不诱导时的生长曲线,发现未诱导菌比经过诱导菌的生长至少延迟一个小时,因此从中可以发现克隆序列中编码的抗镍系统是由镍诱导表达产生的,也说明在质粒pNR21或pNCRABC上至少编码了一个和镍的诱导有关的蛋白。 将连有启动子的序列片段连在报告基因lacZ的上游,发现单独的启动子p1及p2能组成型启动报告基因的表达,而当抗镍系统(由质粒pNCRABC编码)和p1-lacZ,p2-lacZ同时存在时这两个启动子(p1及p2)的启动类型则由组成型转变为诱导型,其中镍是启动的诱导剂。而启动子p3只有在整个抗镍系统存在时才能发挥作用,且是由镍诱导表达的。当缺少抗镍系统中任一成份,启动子p3不能启动。 为了分离和镍诱导有关的蛋白,分别将连有启动子-报告基因的质粒与含有插入突变的质粒pNTA,pNTB及pNTC共转化大肠杆菌JM109,发现只有当ncrB基因突变后,启动子p1及p2的表达类型才能从诱导型转变为组成型。该结果表明基因ncrB的编码产物有可能是与镍诱导有关,它能阻遏启动子p1及p2的启动,而镍离子能解除该阻遏作用。为了进一步证实蛋白NcrB的阻遏作用,构建了重组表达载体pNRB,然后将其与含有启动子(p1或p2)-lacZ的质粒共转化,发现该单独的NcrB即能阻遏启动子p1及p2的启动,而镍离子能解除这种阻遏作用,因此可以证明蛋白NcrB是一个和镍诱导相关的蛋白。