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目的:结直肠癌是最常见恶性肿瘤之一,在全世界范围内发病率较高,且相关死亡率占所有肿瘤第四位,结直肠癌发病率在发展中国家仍有上升趋势,严重影响人类健康,目前研究表明其发生与环境、饮食习惯、遗传及表观遗传变化等有关。现有研究显示线粒体基因组不稳定性与结肠癌发生有关。人类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一条长约16569bp的双链闭环分子,是细胞内唯一存在的核外遗传物质,包含37个基因,其中包括2个r RNA基因和22个t RNA基因,主要参与线粒体内蛋白质的合成。D-Loop区是mtDNA分子复制和转录的调控中心,包含mtDNA的复制起始位点和转录启动子。目前已有研究表明线粒体DNA D-Loop区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与多种肿瘤发病风险相关。本研究中我们通过对150例结肠癌患者及159例正常人mtDNA D-Loop区的SNPs进行对比分析,以期揭示其与结肠癌发病风险的关系。方法:1研究对象:结肠癌组患者为2006年1月~2008年12月间,在河北医科大学第四医院外二科住院的手术患者,术前经内镜检查、组织病理确诊为结肠癌,并行结肠癌根治手术。结肠癌组150例抗凝静脉血标本,均取自结肠癌患者术前静脉血样;对照组159例抗凝静脉血标本,均来自2013年10月~2014年10月间,在河北医科大学第四医院体检的正常人,详细记录体检资料,并除外相关疾病,取静脉血样3ml。所有标本均经过河北医科大学第四医院伦理委员会批准。2线粒体DNA提取:用DNA纯化试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)提取结肠癌组及正常对照组静脉血标本的线粒体DNA,DNA经鉴定合格后置于4℃恒温冰箱中保存备用。3线粒体DNA扩增及测序:采用PCR技术获取目的DNA片段,序列5’-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3’作为上游引物,序列5’-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3’作为下游引物,用PCR预混试剂盒进行扩增,PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳方法证实后,进行DNA产物测序,采用ABI PRISM?Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒,测序时应用ABI PRISM?3100测序仪。每一个标本测序均采用双向重复的方式。4统计分析:计量资料采用u检验进行比较,计数资料采用χ2检验进行比较。所有数据均采用SPSS19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)统计软件进行统计分析,P<0.05被认为有统计学意义。结果:1对结肠癌组与正常对照组临床资料进行分析,性别、年龄无差异,均衡可比(P>0.05)。2在正常对照及结肠癌组中,共检测到138个多态变异位点,多态率为14.1%。两组中高频率(>5%)的单核苷酸多态性变异数共24个,用以分析与肿瘤发病风险的关系。3对结肠癌组与正常对照组mtDNA D-Loop区的SNPs分布频率进行分析,共发现7个多态性变异位点(73A/G,146T/C,195T/C,309C/C insert,324C/G,16261C/T,16304T/C)与结肠癌发病风险有关。在73位点,G基因型在结肠癌组分布频率为92.7%,正常对照组分布频率为56.0%,结肠癌组明显高于正常对照组(P=0.000)。146位点,T基因型在结肠癌组分布频率为92.0%,而正常对照组为84.3%,结肠癌组高于对照组(P=0.037)。195位点,T基因型在结肠癌组分布频率为97.3%,而正常对照组为91.2%,结肠癌组高于对照组(P=0.021)。在309位点,结肠癌组中47.3%患者存在1个或2个碱基C插入,对照组中为63.5%,结肠癌组低于正常对照组(P=0.004)。324位点,C基因型分布频率为100%,正常对照组为95.0%,结肠癌组高于对照组(P=0.005)。另外,16261C基因型在结肠癌组分布频率为99.3%,高于正常对照组的91.8%(P=0.002)。16304T基因型在结肠癌组分布频率为95.3%,高于正常对照组的85.5%(P=0.004)。4将与结肠癌发病风险相关的高频率SNPs和患者临床特征进行比较分析,结果显示分布频率与临床特征(性别、年龄、肿瘤分期及肿瘤长径)无关(P>0.05)。结论:1结肠癌患者mtDNA的D-Loop区是一个具有高度多态性的区域,SNPs以单碱基置换、插入为主,主要分布于第1高变区(HVl)和第2高变区(HV2)。2 mtDNA D-Loop区的SNPs与结肠癌发病风险有关,携带73G、146T、195T、309C、324C、16261C和16304T基因型的个体更易患结肠癌。3 D-Loop区的多态性改变有望成为评估结肠癌发病风险非常有价值的指标。