论文部分内容阅读
目的:人类白细胞分化抗原36(Cluster of Differentiation,CD36),又名脂肪酸转运酶(Fatty Acid Translocase,FAT)是连接机体脂肪酸代谢和炎症发生的重要膜糖蛋白;同时,它又与机体的葡萄糖代谢过程紧密相连。大量研究证实机体FAT/CD36蛋白的高表达与非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)和胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)等代谢综合症(Metabolic Syndrome,MS)的发生呈正相关关系;同时,有研究发现FAT/CD36基因缺失也能引起肝脏NAFLD和IR的发生,但其中具体发病的分子机制目前仍然不完全清楚。本研究旨在初步探讨FAT/CD36基因缺失在加重肝脏胰岛素抵抗发生中的作用及机制,为临床上预防和治疗与FAT/CD36蛋白有关的IR和2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)提供相关的理论基础。1方法:第一部分、选取6-8周龄具有C57BL/6J遗传背景基因的雄性野生型(WT)小鼠作为体内实验动物模型,分别予以正常饮食饲料(Normal Chow Diet,NCD)和高脂肪酸饮食饲料(High Fatty Diet,HFD)喂养12周。饲养期间,每周称取小鼠的体重并记录;在喂养到第10和第11周分别对两组小鼠进行葡萄糖耐量试验(Glucose Tolerance Test,GTT)和胰岛素耐量试验(Insulin Tolerance Test,ITT)的检测,了解机体对葡萄糖的代谢和对胰岛素刺激的敏感性情况。小鼠造模喂养期结束后麻醉解剖,取小鼠血清和肝脏组织分别做以下试验检测:血清葡萄糖和胰岛素浓度检测,了解机体对葡萄糖的代谢和胰岛素分泌情况;肝脏组织石蜡切片苏木精-伊红(H&E)染色和冰冻切片油红O(Oil Red O,ORO)染色以及新鲜肝脏组织中甘油三脂(TG)含量的定量检测,了解肝脏细胞脂肪变性的严重程度和肝内脂质蓄积的情况;蛋白免疫印迹(Western Bloting)技术检测肝脏FAT/CD36蛋白表达的水平,了解HFD能否诱导肝脏FAT/CD36蛋白的异常高表达;Western-blot技术检测肝脏胰岛素信号通路相关蛋白(蛋白激酶B,AKT和磷酸化蛋白激酶B,p-AKT)的表达水平,了解肝脏胰岛素信号通路的活化水平。第二部分、选取6-8周龄具有C57BL/6J遗传背景基因的雄性野生型(WT)和FAT/CD36基因敲除(CD36-/-)小鼠作为体内实验动物模型,分别予以高脂肪酸饲料(HFD)喂养12周。造模饲养期间,每周称取两组小鼠的体重并记录;喂养结束后麻醉解剖,取小鼠血清和肝脏组织分别做以下试验检测:称取每只小鼠肝脏重量并记录,计算肝脏与体重的比值;血清胰岛素水平检测了解机体胰岛素的分泌情况;血清FFA、TG和TC水平检测,了解机体内脂质的代谢情况;血清TNF-α和IL-6水平检测,了解机体全身的炎症水平;肝脏组织石蜡切片的H&E染色和冰冻切片的ORO染色以及新鲜肝脏组织中TG含量的定量检测,了解肝脏细胞脂肪变性程度和肝脏内脂质蓄积情况;实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术分别检测炎症因子(TNF-α;IL-6和IL-1β)和巨噬细胞趋化因子(巨噬细胞趋化蛋白1,MCP-1;巨噬细胞炎性蛋白1,MIP-1和巨噬细胞炎性蛋白2,MIP-2)的基因表达水平以及小鼠肝脏成熟巨噬细胞表面标志物(F4/80)的免疫组织化学染色检测肝脏巨噬细胞的浸润情况和肝内炎症因子水平;Western-blot技术检测肝脏胰岛素信号通路相关蛋白(磷脂酰肌醇3激酶,PI3K;AKT和p-AKT)的表达水平,了解肝脏胰岛素信号通路的活化情况。第三部分、选取人类肝癌细胞株Hep G2细胞,分别予以人白细胞介素6,(IL-6 20ng/ml)和人肿瘤坏死因子-α(TNF-α25ng/ml)处理培养,建立体外细胞炎症模型。实验过程中Hep G2细胞加各处理因素后,被分为对照组、TNF-α处理组、IL-6处理组、对照+胰岛素组、TNF-α+胰岛素处理组和IL-6+胰岛素处理组,处理培养24小时后分别进行以下试验检测:Hep G2细胞的葡萄糖摄取和消耗试验,了解Hep G2细胞对葡萄糖的代谢和对胰岛素敏感性的变化情况;Western-blot技术检测细胞的胰岛素信号通路相关蛋白(胰岛素受体底物1,IRS1;AKT和p-AKT)的表达水平,了解Hep G2细胞胰岛素信号通路的激活情况。结果:第一部分、WT小鼠造模喂养12周后各项实验检测结果发现,HFD喂养的小鼠的体重和肝脏FAT/CD36蛋白的表达水平明显增加(P<0.05);GTT和ITT检测发现,HFD喂养的小鼠出现明显的葡萄糖和胰岛素耐量不良;各项血清生化指标检测发现,HFD喂养的小鼠血清葡萄糖和胰岛素的水平明显升高(P<0.05);肝脏组织切片HE和ORO染色以及新鲜肝脏组织TG含量的定量检测发现,HFD喂养的小鼠肝脏细胞出现大量的空泡样脂肪变性,肝脏内脂质蓄积和TG的含量明显增加;肝脏组织蛋白Western-blot检测发现,HFD喂养的小鼠肝脏胰岛素信号通路(P-AKT/AKT)相关蛋白的表达水平明显减少。第二部分、WT和CD36-/-两组小鼠造模喂养12周期间,对小鼠体重统计分析后发现,在喂养的第6周后CD36-/-小鼠的体重较WT小鼠明显减轻,但前者的肝脏体重比却明显增加,肝脏饱满颜色发白,出现明显的脂肪肝形态;血清生化各项检测指标发现,CD36-/-小鼠的血清胰岛素、TG、FFA、TC和IL-6的水平较WT小鼠明显增加(P<0.05);肝脏组织切片H&E和ORO染色以及新鲜肝组织TG含量的定量检测发现,FAT/CD36基因缺失小鼠的肝脏细胞出现明显的空泡样脂肪变性,肝内脂质蓄积和TG的含量明显增加;RT-PCR和F4/80免疫组化染色检测发现,FAT/CD36基因缺失小鼠的肝脏巨噬细胞趋化因子,炎性蛋白和炎症因子的基因转录表达水平明显增加(P<0.05),肝脏F4/80黄染程度明显加重;肝脏蛋白Western Blottting检测发现,FAT/CD36基因缺失小鼠胰岛素信号通路(PI3K/AKT)相关蛋白的表达水平明显减少。第三部分、Hep G2细胞葡萄糖摄取和消耗试验检测发现,炎症因子(TNF-α、IL-6)处理组的细胞较对照组对葡萄糖的摄取和消耗明显减少,同时细胞加胰岛素处理后,炎症因子处理组的细胞对胰岛素刺激的敏感性明显降低,葡萄糖的摄取和消耗较对照组细胞进一步减少(P<0.05);细胞蛋白Western-blot检测发现,炎症因子处理组的细胞较对照组胰岛素信号通路(IRS1/PI3K/AKT)相关蛋白的表达水平明显减低。结论:1、高脂饮食能诱导WT小鼠肝脏FAT/CD36蛋白的异常高表达,同时伴有肝脏胰岛素抵抗的发生;2、FAT/CD36基因缺失能进一步加重高脂饮食诱导的小鼠肝脏胰岛素抵抗,其可能是由于FAT/CD36基因缺失能够促进小鼠肝脏MCP-1的表达,从而加重肝脏巨噬细胞的浸润和炎症因子的水平;3、炎症因子通过损害肝细胞胰岛素信号通路的活化,导致细胞胰岛素抵抗的发生。