肝干/祖细胞移植治疗各种终末期肝病,是目前最具吸引力和最有前景的研究热点。然而,肝再生修复肝损伤的细胞系起源,是造血源性还是肝源性肝祖卵圆细胞仍然备受争议。目前为止,胎肝细胞被认为是满足肝细胞移植条件的唯一细胞来源,其用于肝再生的优点是:(1)移植后不需要选择压力来促使胎肝细胞增殖;(2)细胞移植后长时间继续增殖;(3)同时再造肝细胞和胆管,形成完整的肝小叶。然而,由于胎肝中细胞成分复杂,肝脏干细胞(liver stem cells, HpSCs)缺乏确定的标志,阻碍了胎肝干/祖细胞(fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs)的分离。本研究利用Percoll连续和非连续密度梯度离心法,进行FLSPCs的富集。选取可能的干细胞标志,对富集的胎肝细胞进行干细胞特性的鉴定。体外培养,动态观察FLSPCs的生长和分化模式,研究LSCs对于肝脏形成和损伤修复的作用。进一步利用pAcGFP1-N1转染FLSPCs使其能表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)作为示踪,以搭建研究胎肝肝干细胞移植效果的可靠平台。最后以化学毒剂CCl4制造急性肝损伤模型,初步观察FLSPCs的修复效果。搭建FLSPCs移植修复急性肝损伤的平台,具有双重生物学意义:发掘肝细胞移植的可靠种子来源;明确肝损伤时细胞的迁移机制。研究目的:1.示踪FLSPCs的构建:利用Percoll离心技术富集FLSPCs,转染质粒构建稳定表达GFP的FLSPCs。2.FLSPCs的修复效果:探讨经门静脉移植FLSPCs对大鼠CCl4所致急性肝损伤的影响。研究方法:1.FLSPCs的富集和鉴定将胎龄14 d的大鼠胎肝酶消化后,利用Percoll非连续密度梯度离心法(Percoll discontinuous gradients centrifugation, PDGC)进行FLSPCs的初次富集。选取7个可能的LSCs标志,行流式细胞仪检测单阳性细胞及双阳性细胞所占的百分率。利用Percoll连续密度梯度离心法(Percoll continuous gradients centrifugation, PCGC)将培养细胞分层。由上至下选取1、2层作为二次富集后的FLSPCs,进行干细胞的鉴定。2.扩增和纯化以含有EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化5 min为限,弃去上层漂浮的细胞;当细胞进行传代培养时,以贴壁时间100 min为界限,超过该段时间未发生贴壁的细胞去除,余下的细胞继续培养。3.FLSPCs的转染示踪提取pAcGFP1-N1质粒,1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定质和量合格。以脂质体转染法,将pAcGFP1-N1质粒导入FLSPCs。利用新霉素梯度筛选法,获得稳定转染的FLSPCs。4.FLSPCs的移植修复将近交系SD大鼠随机分成空白对照组(A)、损伤造模组(B)和FLSPCs移植组(C)。A组腹腔注射生理盐水,B、C组腹腔注射CCl4。24h后戊巴比妥腹腔麻醉,消毒开腹,B组门静脉注入生理盐水,C组门静脉注入GFP示踪的FLSPCs悬液。4 wk后,采血测定肝功能,取组织标本行HE染色观察病理,并利用荧光显微镜追踪GFP标记的细胞。研究结果:1.经流式检测发现,经PDGC初次富集的FLSPCs干细胞标志表达率均在50%以上,包括常用的标志CD133和CD49f,尤其CD117和C-Met表达率达到85%以上。40% Percoll溶液作为梯度介质,以PCGC能将较好地将细胞分层。随着细胞层次的增加,即细胞大小的增长,干细胞表面标志逐渐下降(P<0.05)。尤其是第4层,干细胞表面标志骤降,提示成熟细胞层的出现。经过二次富集,FLSPCs的CD133和CD49f表达率达到73%以上。2.随着体外扩增,细胞出现了大小的不均一性。经胰酶消化后,较大的细胞在5 min左右回缩被消化,体积较小的细胞则保持原状态。经传代培养时,较小的细胞在100 min时几乎都贴壁伸展,较大的细胞难以贴壁,经过去除后,细胞群呈现较好的一致性。3.转染pAcGFP1-N1质粒后4 h,蓝光激发下,荧光显微镜观察到个别细胞发出绿光的FLSPCs。转染后10 d,大量细胞发出荧光,细胞分布欠均匀。转染后20 d,大量细胞发出绿色荧光,密度分布较一致。30 d后,检测到转染率为60%。在新霉素的挑选下,未转染的细胞逐渐凋亡,最终为荧光细胞替代。4.A、B、C三组血清ALT、AST水平差异明显(P<0.01),说明模型制造是成功的,且经门静脉移植FLSPCs能有效缓解CCl4致急性肝功能损伤水平。病理检测显示:A组肝脏损伤轻微;B组大量炎细胞浸润,大面积肝细胞坏死,部分肝板结构破坏;C组炎细胞浸润,部分肝细胞水肿、脂肪变性,肝板结构完整。揭示门静脉注入FLSPCs能有效改善CCl4所致急性肝病理损伤程度。冰冻切片荧光显微镜下可以观察到由FLSPCs分化而来的肝细胞形成的肝板结构,提示其参与肝脏的再生与修复。研究结论:1.成功建立了一套简单有效的富集纯化、体外扩增FLSPCs的方法,该方法不但能保证FLSPCs的数量,而且可以调整FLSPCs的纯度。2.成功构建了GFP稳定示踪的FLSPCs,为细胞移植和体外分化研究检测提供依据。3.经门静脉FLSPCs移植,对CCl4所致同一近交系大鼠严重的急性肝损伤起到明显治疗作用,并观察到其参与了损伤肝脏的再生与修复。