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研究背景及目的胰岛素抵抗(insulin resistence,IR)状态下,体内胰岛素(insulin,Ins)水平相对升高,促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)过度增生,导致血管增殖性病变。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)为胰岛素信号通路中的重要蛋白,其表达或功能的改变是引起VSMCs增殖的主要原因。雷帕霉素(rapamycin,RAP)是mTOR的特异性抑制剂,具有较强地抑制免疫及抑制VSMCs增殖的作用,因不良反应多,仅用于器官移植抗排异反应和冠脉成形术支架涂层。目前作用于mTOR靶标防治血管增殖性病变的上市药物很少。黄酮类化合物小豆蔻明(Cardamonin,CAR)具有舒张血管、抑制血小板聚集等多种血管保护作用。我室近期实验表明CAR可抑制高糖高Ins培养状态下VSMCs增殖,机制可能与Ins信号通路中mTOR相关。CAR在整体动物中是否产生类似的作用,且通过mTOR介导,有待深入研究。本课题利用高果糖饮食复制伴血管增生性病变的IR大鼠模型,观察CAR对大鼠IR及大血管病变的作用,同时考察大鼠血管组织mTOR及其下游分子mRNA及蛋白表达量的变化,探讨CAR作用的可能靶标及机制。方法SD大鼠适应性喂养1w后随机分为空白对照组(CG)和高果糖组(FrcG),分别给予普通饲料和60%高果糖饲料,连续4 w,复制IR模型。眼眶静脉丛穿刺取血,已糖激酶法测空腹血糖(FBG)、放免法测空腹血清胰岛素(FINS),计算HOMA模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(ISI),HOMA-IR大于空白对照组均数加1个标准差且ISI小于正常组均数减1个标准差者视为IR造模成功。IR大鼠继续给予高果糖饲料,每2 w各组随机杀检2只,光镜及电镜下观察胸主动脉中膜层弹力纤维、细胞排列以及VSMCs超微结构,若中膜层增厚,VSMCs内异染色质增多,细胞器丰富,视为伴血管增生性病变IR大鼠模型复制成功。再将高果糖组大鼠按体重随机分为高果糖模型组(FMG)、溶剂组(SG)、RAP组(RAPG,0.8 mg·kg-1)、CAR高剂量组(HCARG,7.5 mg·kg-1)、CAR中剂量组(MCARG,5 mg·kg-1)、CAR低剂量组(LCARG,2.5 mg·kg-1),每组各8只。CG、FMG给予等量生理盐水;SG按体重给予等浓度的溶媒;RAPG、HCARG、MCARG、LCARG给予相应药物,剂量根据文献报道及预试验结果选定,给药途径为腹腔注射,每日1次,维持4 w。给药结束,分别测定血清FBG、FINS、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、尿素、肌酐、丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶及全血凝血时间(TBC),计算HOMA-IR、ISI、大鼠胸主动脉中膜层与管腔面积比(MA/LA),采用免疫组织化学法测定mTOR、p-P70S6K1蛋白表达,荧光实时定量RT-PCR法测定mTOR、P70S6K1、4E-BP1 mRNA表达量。整个实验过程,每周测量大鼠体重(BW)、每日进食量及饮水量。结果1.造模起始至8 w,FrcG大鼠BW、每日进食量及饮水量与CG组无显著差异。给药4 w后,各组大鼠BW、每日进食量及饮水量组间亦无明显差异。2.造模4 w,FrcG大鼠FBG、FINS、HOMA-IR较CG组明显升高(8.09±1.14 vs 6.52±0.95 mmol/L,P<0.01;32.2±9.2 vs 21.7±7.7 mIU/L,P<0.01;11.06±2.70 vs 5.35±0.98,P<0.01)、ISI较CG组明显下降(-5.49±0.37 vs -4.87±0.38,P<0.01),说明IR模型复制成功。继续造模至8 w,Frc组FBG、FINS、HOMA-IR、ISI与CG组比较的趋势和显著性差异与4 w时相似,FINS较4 w显著增加(36.8±9.5 vs 32.2±9.2,mIU/L,P<0.01),说明造模时间延长,Frc组高胰岛素血症加重;8 w镜检,Frc组大鼠胸主动脉中膜层增厚,弹力纤维及VSMCs排列不规则,且平滑肌细胞肿大变性,胞浆内有空泡形成,胞核皱缩,异染色质增多,细胞器较丰富,提示VSMCs增生活跃,IR所致血管增生性病变模型形成。3.给药4 w,SG组与FMG组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI、TG、TC、TBC无明显差异,表明溶剂对所测指标无影响。FMG组FINS、HOMA-IR、TG、TC较CG组显著增加(P<0.05或P<0.01),ISI、TBC较CG组显著减少(P<0.01),说明模型大鼠存在IR、脂代谢及凝血异常。RAPG组FBG、FINS、HOMA-IR、ISI、TBC与FMG组无显著差异,TG、TC较FMG组明显升高(P<0.01,P<0.05)。低、中、高剂量CAR干预组大鼠与FMG组比较FINS、HOMA-IR明显降低(P<0.01),ISI明显增加(P<0.01),且呈剂量依赖性,提示CAR可改善IR,以中、高剂量效果好。三种剂量CAR干预后大鼠TG与FMG组无明显差异,高剂量CAR可明显升高TC(P<0.05)及延长模型大鼠TBC(P<0.01)。各组间比较,大鼠血清尿素、肌酐、丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶无明显差异。4.给药4 w,大鼠胸主动脉MA/LA SG组与FMG组间无明显差异。FMG组MA/LA较CG组明显增加(P<0.01),说明血管壁增厚。RAP及三种剂量CAR干预均可显著降低模型大鼠MA/LA,抑制血管壁重构增厚。5.给药4 w,SG组大鼠胸主动脉mTOR、p-P70S6K1蛋白表达与FMG组无明显差异。FMG组mTOR、p-P70S6K1蛋白水平明显高于CG(P<0.01)。RAP及三种剂量CAR可显著降低模型大鼠mTOR蛋白表达量(P<0.01),且中、高剂量CAR与RAP作用无明显差异,低剂量作用不及RAP(P<0.05)。RAP及中、高剂量CAR显著抑制p-P70S6K1蛋白表达(P<0.01),低剂量CAR作用不明显。6.给药4 w,SG组大鼠胸主动脉mTOR、P70S6K1、4E-BP1 mRNA表达量与FMG组无明显差异。FMG组mTOR、P70S6K1、4E-BP1 mRNA表达明显高于CG(P<0.01)。RAP及各剂量CAR可使模型大鼠mTOR、P70S6K1、4E-BP1 mRNA水平显著下调(P<0.01),且高剂量CAR下调P70S6K1、4E-BP1 mRNA作用较RAP强(P<0.01),高、中、低剂量CAR对P70S6K1 mRNA表达的影响存在程度差异。结论高果糖饲料喂养12 w的模型大鼠出现IR、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高凝血状态,且mTOR信号转导通路异常激活,引起胸主动脉VSMCs增殖及管壁增厚。CAR可改善整体动物IR及高凝血状态,逆转血管增生性病变,其机制可能与作用于mTOR靶标,降低病变大鼠FINS,延长TBC,呈剂量依赖性抑制大鼠胸主动脉mTOR、P70S6K1、4E-BP1 mRNA及mTOR、p-P70S6K1蛋白表达有关。CAR作用的确切靶标及精细机制有待进一步研究。