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在化学合成制药工业中,由腈化合物发生水合反应生产相应的酰胺是一类重要的化学反应。然而,化学合成法必需苛刻的反应条件,如强酸、强碱和高温等。与此相比,生物转化法体现出化学法无法比拟的优势,不仅反应高效专一,反应条件温和,而且具有独特的化学选择性、区域选择性和立体选择性的特点。在生物催化过程中,筛选高效的生物催化剂是其技术核心。腈水合酶（EC 4.2.1.84）是微生物降解腈化合物的双酶途径中的关键酶,能够催化水合反应生成高附加值的酰胺化合物,从而被广泛地应用于制备医药、农药中间体等精细化工产品等。目前,采用腈水合酶生物法生产酰胺化合物基本上都是采用野生菌细胞。然而,由于在同一基因簇中也存在着酰胺酶基因,因此酰胺易被进一步水解为羧酸,不仅降低产品的得率,而且影响整个纯化过程工艺。本论文试图采用基因组探矿技术筛选新型的腈水合酶基因,并在E.coli细胞中构建重组表达体系,探索一种可替代的微生物法制备高质量酰胺化合物的生产策略。目前已经通过实验证明其功能的腈水合酶基因的数目较少,据我们所知不超过40种,而且基因来源比较单一。尤其是铁型腈水合酶,除了一例Pseudomonas chlororaphis B23腈水合酶外,其它均来源于红平红球菌Rhodococcus erythropolis,后者的蛋白质序列同源度非常高,一致度大于95%。因此,我们首先构建一种基于蛋白质保守片段搜索的腈水合酶基因探矿策略。采用此方法,从GenBank数据库中搜索到大量的假定腈水合酶基因,都来源于已完成测序计划的微生物基因组中,具有完整的基因数据信息。从挖掘的结果中发现,可用的铁型腈水合酶基因的数目在数据库中相对较少,仅仅搜索到20种假定的基因,蛋白质序列的同源度分布在45～99%之间。基因来源除了常见的红球菌属Rhodococcus,假单胞菌属Pseudomonas是另外一大类,另外还有伯氏菌属Burkholderia、不动杆菌属Acinetobacter、贪食菌属Variovorax、食酸菌属Acidovorax等微生物中。而对于钴型腈水合酶,在数据库中发现大量的基因数据信息,本文仅筛选了其中的56种假定钴型腈水合酶基因,分别来源于不同的微生物,包括红球菌属Rhodococcus、链霉菌属Streptomyces、芽孢杆菌属Bacillus,假诺卡氏菌属Pseudonocardia、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium等。针对铁型腈水合酶的研究,我们克隆和表达了来源于Pseudomonas putida F1的腈水合酶基因,并对其酶学性质进行系统的表征。NHaseF1的蛋白质序列与Rhodococcus erythropolis腈水合酶同源度较低,相似度<60%。同时结果也发现,毗邻于β-亚基下游的Pput2730基因对NHaseF1在E. coli细胞中的功能表达非常关键。只有在腈水合酶基因和Pput2730基因共表达时,表达产物才以可溶蛋白的形式存在,而且表现出腈水合酶的活力。因此,结果建议Pput2730基因作为腈水合酶的活化元件,直接关系到NHaseF1在E. coli细胞中的活性表达,其部分功能可能参与了蛋白质的正确折叠。与其它大多数铁型腈水合酶比较,NHaseF1表现出更宽的底物谱,包括脂肪族、芳香族腈化合物。尤其,NHaseF1可以催化3-氰基吡啶生产烟酰胺。因此,重组NHaseF1在某些重要酰胺化合物的制备中具有很高的应用潜力。一般情况下,钴型腈水合酶表现出更宽的底物谱,尤其是针对芳香族腈化合物。因此,我们克隆和表达了6种不同来源的腈水合酶,分别来源于Silicibacter pomeroyi DSS-3, Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1, Bradyrhizobium japonicum USDA110, Pseudomonas putida 5B, Mesorhizobium loti JCM 21590和 Sinorhizobium meliloti NRRL L-45,都具有水合3-氰基吡啶生产烟酰胺的活力。再通过比较,A. manganoxydans SI85-9A1腈水合酶具有更高的3.氰基吡啶水和活力,命名为NHase08,作为后续工作的研究重点。另外,虽然NHase08属于钴型腈水合酶家族,然而其结构基因顺序为-α-β-,不同于大多数已报道的钴型腈水合酶基因顺序：-β-α-。同时发现,与β亚基下游毗邻的一段假定基因,SI859A100581,对NHase08的功能表达具有决定性的作用,但是不影响蛋白的可溶性表达。值得关注的是,重组NHase08表现出较高的热稳定性,最适反应温度为50℃。而且,在不加任何保护剂的条件下,50℃时半衰期达到1.5 h。为了实现重组NHase08的规模化制备,我们设计和优化了一种适合工业化应用的自动诱导培养基,AIM,不仅生产成本大幅度降低,而且NHase 08的表达水平与传统IPTG诱导结果基本相当。采用AIM培养基,在10-L发酵罐分批补料发酵中,最终菌体密度达到39.5g/L（干重）,腈水合酶活力为2170U/ml培养液,目标蛋白的表达水平>25%。烟酰胺属于B族维生素,是生物体内辅酶Ⅰ或Ⅱ的组成部分,可以作为膳食,以及动物饲料的添加剂,具有广泛的应用和市场前景。重组NHaseF1和NHase08都能转化3-氰基吡啶生产烟酰胺。以3-氰基吡啶为底物,纯化后重组NHaseF1的比活为26.6 U/mg蛋白,而NHase08比活为404.5 U/mg蛋白。在1L的分批补料反应中,采用重组NHase08全细胞催化,5 h完全转化了3.6摩尔3-氰基吡啶为烟酰胺,几乎没有任何副产物的产生。因此,鉴于重组NHase08表现出较高的催化效率和热稳定性,更适合应用于烟酰胺的工业化制备中,而且本文所设计的自动诱导策略也有利于重组NHase08的大规模生产。