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脑胶质瘤是中枢神经系统发生率最高的恶性肿瘤，目前国内外针对脑胶质瘤的治疗原则，强调在手术切除肿瘤的基础上，联合放疗和化疗。因血脑屏障（blood brainbarrier，BBB）的存在，化疗效果欠佳。近年来，随着材料科学的发展，将材料科学与医学有机结合的纳米医学逐渐成为研究的热点。纳米氧化石墨烯（nanoscaledgraphene oxide，nGO）具有良好的生物安全性，并能大量吸附含芳香环类药物，有望成为一种高效的药物载体。文献报道胶质瘤细胞表面的转铁蛋白受体(transferrinreceptor, TfR)高表达，与转铁蛋白(transferrin,Tf)具有很强的亲和力。本研究选用Tf作为靶向功能基，以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)化的nGO作为药物载体，通过物理吸附作用，使不能透过BBB的小分子化疗药阿霉素（doxorubicine，Dox）物理吸附到氧化石墨烯(graphene oxide,GO)纳米粒的表面，构建了一种新型的具有胶质瘤靶向性的纳米载药系统，并通过体外、体内试验全面地考察其治疗脑胶质瘤的效果。第一部分Tf-PEG-nGO-Dox的合成及检测目的：选用Tf作为靶向功能基，以富含芳香环结构的化疗药物Dox为目标药物，以PEG化的nGO作为Dox的药物载体，使Tf与nGO共价结合，再使Dox物理吸附到Tf-PEG-nGO的表面，构建一种新型的具有胶质瘤靶向性的纳米载药系统。方法将氧化石墨进行机械剥离及纯化得到氧化石墨烯（GO），将GO反复超声振荡及14,000Da透析袋反复透析筛选得到nGO，将得到的nGO与六臂聚乙二醇共价合成得到PEG化的nGO（PEG-nGO），将Tf与PEG-nGO共价结合后，行透析除去未结合的Tf，得到Tf-PEG-nGO；将Dox加入到Tf-PEG-nGO的水溶液中，非共价吸附反应12小时后，反复透析，去除游离的Dox，得到Tf-PEG-nGO-Dox。以原子力显微镜(atomicforce microscope, AFM)检测纳米载体的粒径大小及厚度；对Tf-PEG-nGO-Dox进行红外光谱、拉曼光谱、紫外光谱检测，紫外分光光度计检测Tf-PEG-nGO-Dox的载药量；测定其在不同pH值下Dox的释放速度。结果紫外光谱分析显示nGO最大吸收峰出现在232nm，Tf修饰后，紫外可见光谱出现明显的改变，232nm处的最大吸收峰消失，而在270nm处出现最大的紫外吸收，对应Tf的紫外吸收峰；通过紫外分光光度法对Dox吸附率进行了计算，PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox的Dox浓度分别为240μg/mL及277μg/mL，由此计算出PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox对Dox的吸附率分别为127%及115.4%。采用超声振荡和孔径为220nm的过滤膜对GO进行分选，选择得到直径<220nm能透过过滤膜的nGO，AFM检测显示nGO的厚度约为1nm，Tf-PEG-nGO厚度增加到约5nm，推算nGO及Tf-PEG-nGO层数为1-2层；红外光谱结果表明：产物中含有－COOH、－OH、－CO－等含氧基团。 Dox释放试验显示在酸性条件下， Dox释放明显加快，Tf-PEG-nGO-Dox24、48、72小时Dox释放率分别为15%、25%及30%。结论本研究成功制备了一种粒径介于100-400nm、层数1-2层的Tf-PEG-nGO-Dox纳米药物载体，Tf-PEG-nGO-Dox具有高载药量并在中性条件下稳定存在、酸性条件下加速释放Dox的特性。第二部分Tf-PEG-nGO-Dox治疗胶质瘤的体外研究目的对成功构建的Tf-PEG-nGO-Dox进行一系列较为系统的体外评价，以检测其对胶质瘤细胞的细胞毒作用及靶向性。体外评价包括溶血毒性、细胞毒性、竞争抑制试验、胞内摄取定量试验。方法1、以蒸馏水和生理盐水分别作为阳性、阴性对照，将不同浓度的纳米载体及吸附Dox的纳米药物溶液分别与含2%红细胞悬液37℃下反应2小时，离心后以紫外分光光度计检测上清液在550nm处的吸光度，并计算溶血率。2、以MTT法检测浓度介于0-800μg/mL之间的PEG-nGO、Tf-PEG-nGO对C6细胞的毒性反应，以检验其生物安全性。3、将C6细胞以1×l04/孔密度种于96孔培养板，检测Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox在24h时对C6细胞的抑制作用。4、将C6细胞以1×l04/孔密度种于96孔培养板，C6细胞经Tf预孵育后，再检测Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox在24h时对C6细胞的抑制作用。比较三种药物在经Tf预孵育前后对C6细胞抑制作用的变化。5、胞内摄取定量试验：比较三种药物—Dox裸药溶液、PEG-nGO-Dox溶液、Tf-PEG-nGO-Dox溶液，在相同药物浓度（Dox浓度3μg/mL）条件，相同的细胞培养条件，不同时间点（1、2、4、8、12h），采用弱酸性流动相HPLC法进行Dox的定量测定，检测C6细胞内的Dox总含量，以此考察C6细胞对三种药物的摄取能力。结果1、PEG-nGO、Tf-PEG-nGO、PEG-nGO-Dox、Tf-PEG-nGO-Dox在浓度范围0.1-5.0μM，37℃下与红细胞孵育2小时，紫外分光光度计检测计算出的溶血率均小于6%。2、MTT法检测纳米载体PEG-nGO及Tf-PEG-nGO对C6胶质瘤细胞的抑制率，发现随着载体浓度的增加细胞毒性增加不明显，在PEG-nGO及Tf-PEG-nGO的浓度达到800μg/mL,活细胞比例仍大于80%。3、MTT法检测Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox对C6细胞的抑制作用，三种药物对C6胶质瘤细胞的抑制率随着药物浓度的增加而升高。在相同Dox浓度下，细胞毒性：PEG-nGO-Dox组<Dox组<Tf-PEG-nGO-Dox组。计算出Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox三种药物的IC50值分别为28.43,63.01及13.61μg/mL。4、96孔板上培养C6细胞，每孔予含50μg Tf的100mLDMEM培养基孵育30min，再以MTT法检测Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox对大鼠C6细胞的抑制作用，Tf-PEG-nGO-Dox对C6细胞的抑制作用较未经Tf预处理的Tf-PEG-nGO-Dox明显下降，IC50值由13.61上升到40.16μg/mL。5、在相同药物浓度（Dox浓度3μg/mL）、相同的细胞培养条件下，于不同时间点（1、2、4、8、12h）分别将三种药物作用后的C6细胞以Triton X-100进行细胞裂解，以弱酸流动相HPLC法，测定胞内的Dox总含量；以BCA试剂盒测定每份标本的蛋白总量，以二者比值作为摄取分数（UI），三种药物均随时间延长，进入胞内的Dox量增加，在药物作用2小时后，Tf-PEG-nGO-Dox组的胞内摄取速度明显加速，并超过Dox组及PEG-nGO-Dox组。结论本试验构建的纳米载体及吸附了Dox的载药体系对红细胞的影响很小，没有明显的溶血效应；PEG-nGO及Tf-PEG-nGO对C6细胞活力无明显影响。Tf-PEG-nGO-Dox具有一定的胶质瘤靶向性，可以在Tf的介导下将更多的Dox转运到胶质瘤细胞内，发挥出更大的抗肿瘤效应。第三部分Tf-PEG-nGO-Dox治疗胶质瘤的体内研究目的在成功构建Tf-PEG-nGO-Dox及体外抗胶质瘤试验的基础上，建立大鼠C6胶质瘤脑内移植模型，检测Dox裸药、PEG-nGO及Tf-PEG-nGO-Dox在全身主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、正常脑组织、肿瘤）的组织分布，观察其对肿瘤的抑制率及其荷瘤鼠的生存期。方法1、动物模型制作：雄性SD大鼠以水合氯醛行腹腔注射麻醉后，固定于立体定位仪上。于中线处眼裂后方作1.5cm纵行直切口，暴露前囟，于右侧冠状缝距中线3mm处以电钻钻直径约1.0mm骨孔，暴露硬脑膜。C6细胞悬液置入微量注射器内，垂直进针5mm(距硬膜)，注射10μl含106C6的细胞悬液。2、组织分布实验：建模成功后第10天，将9只实验动物分为3组，分别通过尾静脉注射Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox，在注射后3h，以弱酸流动相HPLC检测Dox在荷瘤大鼠主要脏器及肿瘤内的组织分布情况。3、肿瘤体积的抑制率及生存期检测：12只雄性大鼠，随机平均分为4组：对照组、Dox裸药组、nGO-Dox组和Tf-nGO-Dox组。在颅内接种后的第7、9、11天分别通过尾静脉注射药物，对照组注射生理盐水，其余三组注入药物剂量含Dox1.5mg/kg体重/次。在颅内接种后的第15天，处死所有的实验动物，取出脑组织，测定肿瘤体积。另外将40只颅内接种的雄性大鼠，随机平均分为4组：对照组、Dox裸药组、nGO-Dox组和Tf-nGO-Dox组。在接种后的第7、9、11天分别通过尾静脉注射药物，对照组注射生理盐水，其余三组每次注入药物剂量含Dox1.5mg/kg体重/次。记录所有试验动物生存期。结果给药后3小时，主要脏器及肿瘤组织内的Dox含量如下：Dox裸药组：脾脏>肝脏>肾脏>心脏>肺脏>肿瘤>脑组织；PEG-nGO-Dox组：脾脏>肝脏>肾脏>肿瘤>脑组织>心脏>肺脏；Tf-PEG-nGO-Dox组：脾脏>肝脏>肿瘤>肾脏>脑组织>心脏>肺脏。Tf-PEG-nGO-Dox组肿瘤内的Dox含量较Dox裸药组及PEG-nGO-Dox组明显上升；较正常脑组织内的Dox也明显上升。连续3次给药后，在接种后第15天，Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox三组的肿瘤体积抑制率分别为10%，25%及33%；对照组、Dox裸药组、nGO-Dox组及Tf-nGO-Dox组的中位生存期分别为17、19、21、25天。其中Tf-PEG-nGO-Dox组相对于对照组、Dox裸药组及PEG-nGO-Dox组的生存期延长率分别达到了47.1%，23.5%及11.8%。结论通过立体定向装置，将胶质瘤C6细胞植入SD大鼠颅内，成功构建出胶质瘤颅内移植瘤模型。对荷瘤大鼠行静脉给药，HPLC检测显示Tf-PEG-nGO-Dox在Tf的介导下，可以将更多的Dox转运到颅内移植瘤部位，从而更有效的抑制肿瘤的生长，并明显延长了荷瘤大鼠的生存期。